竹醋液对紫苏镉毒的缓解效应研究

2023-10-07李振国郝星雨贺甜莲景蕊荣成顾承真郑新宇

生态环境学报 2023年7期

李振国，郝星雨，贺甜莲，景蕊，荣成，顾承真，郑新宇

福建农林大学生命科学学院，福建福州 350000

人类活动造成的土壤重金属镉（Cd）污染已成为全球性的环境挑战（Rai et al.，2019）。重金属Cd可以通过食物链进入人体，造成严重的健康危害（Lü et al.，2022），并严重制约农业的可持续发展（Yuan et al.，2021）。超富集植物修复是一种经济和环境友好的修复方式，可以将Cd从土壤中完全去除或转化为危害较小的形式以达到土壤修复目的（Ge et al.，2021），被认为是原位修复Cd污染土壤的有效措施之一（Bhat et al.，2022）。

紫苏（Perillafrutescens）为一年生草本植物，是一种在中国广泛种植的Cd超富集植物（肖清铁等，2018）。此外，该植物富含挥发油，并具有生物量大、生长周期短和经济效益高等优点，可在修复污染土壤的同时产出的挥发性精油，兼具经济效益和环境效益（郑梅琴等，2018）。然而，前期研究发现在采用紫苏对镉污染土壤进行修复时，存在生物量大幅下降的现象，导致其难以大面积推广应用（张洪等，2006；Xiao et al.，2020）。

重金属胁迫下往往引起植物体内的氧化胁迫，导致活氧（ROS）的过度积累，高浓度的ROS则会损伤细胞，危及细胞功能，导致植物生物量的下降（Das et al.，1997）。因此，及时清除ROS可使植物免受毒害。植物体内一些酶类抗氧化物质，如过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等和非酶类抗氧化物质如类黄酮和酚酸类化合物，可清除过量的ROS，以缓解植物的氧化损伤（Ferrer et al.，2008；Martinez et al.，2016；Choudhury et al.，2017）。此外酚酸类化合物还可以固化金属，降低重金属毒性，其单体在细胞壁的酯化醇化还能强化细胞壁的交联作用，进一步增强植物对金属的防御能力。

竹醋液（BV）是竹炭生产过程中的副产物，由竹材缓慢热解产生的一种挥发性、可溶于水的混合物，成分中酚类物质含量较高（张宏等，2014）。研究表明，竹醋液可促进植物生长（Zhu et al.，2021），且无细胞遗传毒性，不会对生物群和人类健康造成不利影响（Sivaram et al.，2022）。在农业生产中，常被用作植物生长调节剂（促进种子萌发（Hagner et al.，2021）、植物生长（Sun et al.，2020）和果实发育（Yu et al.，2017）等）和土壤改良剂（刺激土壤酶活性（Lashari et al.，2013）和减少氨挥发（Win et al.，2009）等）。研究表明，以酸类（Han et al.，2021）、酚类（Saidi et al.，2021）或酮类（Kang et al.，2022）化合物作为植物的外源添加剂，可以缓解植物的Cd损伤和/或提高植物的Cd富集能力。然而，竹醋液作为含有多种有机物的天然环保物质，能否在促进植物生长的同时实现对土壤重金属的高效率修复却鲜有报道。

基于此，本研究利用竹醋液对Cd胁迫下紫苏进行叶面喷施，针对紫苏生物量、镉含量、抗氧化酶活性和非酶类抗氧化物质的分析，探究喷施BV对Cd胁迫下紫苏生理的影响，以期阐明BV对植株Cd胁迫的毒性缓解效应，为植物高效修复镉污染土壤提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

紫苏（Perillafrutescens）种子购自江西省会昌县祖有种养场，为实验室前期筛选镉的超富集植物。竹醋液由福建省建瓯市恒顺炭业有限公司提供，在隔绝空气下加热，热解温度450 ℃、升温速率为10 ℃·min-1下制得。收集到的冷凝物在沉淀和过滤后，室温放置6个月后使用。竹醋液的特性是：pH值2.2，总有机碳质量浓度835.9 mg·L-1，总氮225.4 mg·L-1，总磷96.1 mg·L-1，总钾27.3 mg·L-1，镉未检出。

采用GC-MS仪（安捷伦7890B-7000D，美国）对竹醋液进行组分分析。GC条件：色谱柱为HPVOC（60 m×200 μm×1.1 μm），柱温40 ℃，恒温3 min后，以5 ℃·min-1速度升温至80 ℃，恒温5 min，再以5 ℃·min-1速度升温至140 ℃，恒温1 min，再以40 ℃·min-1速度升温至270 ℃，恒温6 min；载气为氦气，分流比10:1，进样量1 μL。进样口温度200 ℃，接口温度280 ℃。MS条件：EI源，电子能量70 eV，扫描质量范围（m/Z）为10－500。有机物成分见表1。

表1 竹醋液中有机物的组成及其相对含量Table 1 Composition and relative content of organic matter in bamboo vinegar

1.2 水培试验

紫苏幼苗的培养和移植参照Xiao et al.（2020）。待紫苏幼苗长至四叶期（约25 d），移植于42 cm×30 cm×15 cm的黑色塑料盆中，每盆9株，内含10 L Hoagland完全营养液，调节pH至6.0左右，适应性生长7 d，以待后续处理。

本研究在试验处理前开展预实验，考察了不同稀释倍数（50、100、300倍和500倍）竹醋液对不同浓度（0、4 mg·L-1和8 mg·L-1）镉胁迫下紫苏生长的影响。通过观察地上部和地下部的发育情况发现，在8 mg·L-1镉胁迫下，紫苏根系变黑，地上部几乎停止生长，而稀释300倍竹醋液可以促进8 mg·L-1镉胁迫下紫苏的生长。稀释50倍竹醋液会抑制不同浓度镉胁迫下紫苏的生长，其它稀释倍数竹醋液均不同程度的促进镉胁迫下紫苏的生长，以稀释300倍竹醋液处理下，紫苏生物量增加最多。

根据以上结果，本研究以稀释300倍竹醋液作为叶面喷施浓度，每盆喷施20 mL，每4天进行1次喷施，喷施时间为上午10:00，在预施竹醋液8 d后，更新营养液并用CdCl2溶液处理，将溶液的Cd2+浓度调整为0、4 mg·L-1和8 mg·L-1。水培实验在温室中进行，光照强度为180 μmol·m-2·s-1，光周期为12 h光照/12 h黑暗，温度为光照25 ℃/黑暗22 ℃，湿度为60%。营养液Cd2+处理浓度0、4 mg·L-1和8 mg·L-1命名为Cd0、Cd4和Cd8，未喷施竹醋液命名和喷施竹醋液命名UBV和BV。

1.3 取样与指标的测定

1.3.1 取样

在竹醋液处理16 d后采集植物样本。每个处理随机抽取5个植株，用0.1 mol·L-1的EDTA溶液仔细清洗根系，用蒸馏水冲洗3次。然后把它们分成根、茎和叶，一部分样品放入信封中在105 ℃下干燥30 min，然后在72 ℃下干燥48 h，称重并研磨过60目筛，以分析Cd浓度。其余样品用液氮冷冻，并在-80 ℃下储存，以测定其它指标。

1.3.2 类黄酮含量的测定

类黄酮含量的测定采用含1% HCl的甲醇溶液浸提，测定参照Dou et al.（2018）。

1.3.3 镉含量的测定

环境中镉含量的测定是以50 mL水培液在70 ℃下蒸发至5 mL作为待消解样品，采用HNO3-HClO4（V/V=9:1）双酸消化法对水培液以及植物地上部和地下部样品进行消解，通过ICP-MS仪（安捷伦7700，美国）分析镉浓度。

1.3.4 抗氧化酶活性和MDA含量的测定

过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定分别采用愈创木酚法、氮蓝四唑光化还原法、高锰酸钾滴定法和抗坏血酸比色法，丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法（李忠光等，2008；汪敦飞等，2019）。

1.3.5 酚酸含量的测定

可溶性酚酸基于80%预冷甲醇溶液提取，取醇不溶的沉淀，用于结合态酚酸的提取（谭新中等，2010）。酚酸含量的测定参照郑新宇等（2013），采用HPLC仪（安捷伦1260，美国）测定。

1.4 数据处理

采用不均匀平均法计算紫苏全株中Cd的含量。富集系数（BCF）为植物体内Cd质量分数与环境中Cd质量分数的比值，转运系数（TF）为植株Cd质量分数与地下部Cd质量分数的比值。总酚酸含量为可溶性酚酸与结合态酚酸的总和。数据的处理采用SPSS 25软件进行统计分析，Origin 2022软件对数据进行主成分分析（PCA），Pearson相关性分析用于检测两者之间的关系。所有结果以均值±标准差（SD）表示。在满足正态性和方差齐性的情况下，基于最小显著差异检验（LSD）分析（P<0.05）。所有图片均采用Origin 2022软件绘制。

2 结果分析

2.1 竹醋液对紫苏镉富集能力的影响

本研究4 mg·L-1和8 mg·L-1Cd浓度处理下以及喷施BV后植株的单株总Cd富集量、地上部Cd含量、地下部Cd含量、BCF和TF进行了检测。

如图1a所示，未喷施BV处理下，Cd4和Cd8处理下单株总Cd富集量为737 μg·plant-1和683 μg·plant-1，喷施BV分别显著提高了69.3%（P<0.001）和55.7%（P<0.001），且以喷施BV的Cd4处理下，地上部Cd富集量最多，达到641 μg·plant-1；如图1b和c所示，未喷施BV下，Cd4和Cd8处理下的地上部以及地下部Cd质量分数分别为647、411、2654 μg·g-1和5291 μg·g-1。而喷施BV增加了Cd4和Cd8处理下紫苏的地上部镉含量和地下部Cd含量，在Cd4处理下分别增加了16.5%（P=0.001）和14.0%（P=0.024），在Cd8处理下分别显著增加了21.4%（P=0.003）和62.8%（P<0.001）；如图1d、e所示，未喷施BV下，Cd4和Cd8处理BCF分别为240和131，TF分别为0.244和0.078。喷施BV导致紫苏在Cd4和Cd8处理下的BCF分别提高了23.8%（P<0.001）和29.3%（P=0.002），而Cd8处理下，TF降低了25.0%（P=0.048），Cd4处理下的TF无显著影响。如图1f所示，在未喷施BV处理下，Cd8较Cd0处理下干重显著降低了14.0%，Cd4较Cd0处理无显著差异；在Cd0、Cd4和Cd8处理下，喷施BV较未喷施分别显著增加了28.9%、36.8%（P<0.001）和20.6%（P<0.001）。总之，喷施BV可以促进不同Cd浓度下紫苏的单株总Cd富集量，且促进效果为Cd4>Cd8。

图1 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd浓度处理下，紫苏的单株总Cd富集量（a）、Cd含量（b－地上部、c－地下部）、BCF（d）、TF（e）和干重（f）的影响Figure 1 Effects of BV spray on total Cd enrichment (a),Cd content (b–aboveground part,c–underground part),BCF(d),TF(e) and dry weight (f) of Perilla frutescens per plant at 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations

2.2 竹醋液对镉胁迫下紫苏类黄酮含量的影响

如图2a所示，未喷施BV时，Cd8和Cd4较Cd0处理叶中类黄酮质量分数分别显著增加了13.0%（P<0.001）和59.4%（P<0.001）；在Cd0、Cd4和Cd8处理下，喷施BV较未喷施相比，叶中类黄酮质量分数分别显著增加了17.8%（P=0.004）、80.0%（P<0.001）和31.9%（P<0.001）。

图2 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd处理紫苏的类黄酮含量（a－叶、b－根）的影响Figure 2 Effects of BV spray on flavonoid content (a–leaves,b–root)of Perilla frutescens treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd

同时，类黄酮含量在根中也表现出不同的差异（图2b）。未喷施BV时，Cd4较Cd0处理根中类黄酮质量分数无显著差异。Cd8较Cd0处理根中类黄酮质量分数显著降低了70.2%（P<0.001）；喷施BV使Cd0和Cd4处理下根中类黄酮质量分数显著增加了13.8%（P=0.003）和34.7%（P<0.001），对Cd8处理下根中类黄酮质量分数无显著影响。可见，喷施BV可以提高紫苏类黄酮含量。

2.3 根和叶中酚酸

本研究对紫苏的14种酚酸类物质进行了检测，包括没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、香兰素、对香豆酸、阿魏酸、异绿原酸A、香豆素、苯甲酸、迷迭香酸和肉桂酸。Cd处理下，根和叶中酚酸均有不同程度的提高。喷施BV后，在Cd0、Cd4和Cd8处理下，叶中总酚酸质量分数较未喷施相比分别显著增加了36.9%、93.6%和30.9%（P<0.001，图3a）。根中总酚酸质量分数在Cd0处理下显著降低了46.2%（P<0.001），Cd4和Cd8处理下显著增加了25.3%和31.2%（P<0.001，图3b）。Cd和BV处理对紫苏根和叶的酚酸质量分数表现为正向协同效应。

图3 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd处理紫苏的总酚酸含量（a－叶、b－根）Figure 3 Total phenolic acid content (a–leaves,b–root) of Perilla frutescens treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd by spraying BV

2.3.1 根和叶中可溶性酚酸

叶中可溶性酚酸除阿魏酸未被检测到，其余均被检测到（表2）。叶中可溶性酚酸含量为：异绿原酸A>苯甲酸>迷迭香酸>香兰素>香豆素>原儿茶酸>对香豆酸>丁香酸>咖啡酸>绿原酸>对羟基苯甲酸>肉桂酸>没食子酸；根中检测到8种可溶性酚酸，苯甲酸>绿原酸>咖啡酸>异绿原酸A>对羟基苯甲酸>丁香酸>香豆素>原儿茶酸（表3）。且可溶性酚酸总量表现为叶>根。

表3 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd处理下紫苏根中可溶性酚酸含量影响Table 3 Effects of BV spray on soluble phenolic acid content in Perilla frutescens root treated with 0,4 mg·L-1and 8 mg·L-1

如表2所示，在未喷施BV时，Cd0、Cd4和Cd8处理下叶中总可溶性酚酸质量分数分别为627、654、1026 μg·g-1。喷施BV较未喷施相比，Cd0、Cd4和Cd8处理下叶中总可溶性酚酸质量分数分别显著增加了37.8%（P<0.001）、136.2%（P<0.001）和49.8%（P<0.001）。在所有被检测的叶可溶性酚酸中，Cd处理下均有不同程度的改变，以Cd8处理下咖啡酸、没食子酸、丁香酸和香兰素的质量分数变化较大，分别为Cd0的6.9、3.5、2.8、2.3倍。喷施BV导致Cd4处理下香豆素、咖啡酸和香兰素的质量分数变化较大，分别为未喷施的5.9、4.3、2.4倍。其中含量较高的异绿原酸A、苯甲酸和迷迭香酸，在Cd4处理下，喷施BV分别为未喷施的1.6、2.7和4.5倍。此外，没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸和对香豆酸在喷施BV后也有不同程度的增加。

如表3所示，在未喷施BV时，Cd0、Cd4和Cd8处理下根中可溶性酚酸质量分数分别为62.9、76.8、126 μg·g-1。喷施BV较未喷施相比，Cd0处理下根中可溶性酚酸质量分数无显著差异，Cd4和Cd8处理下根中可溶性酚酸质量分数分别显著增加了31.8%（P=0.007）和76.1%（P<0.001）。在所有被检测的根可溶性酚酸中，Cd处理下均有不同程度的改变，以Cd8处理下丁香酸、异绿原酸A和苯甲酸的质量分数变化较大，分别为Cd0的2.2、3.3和2.5倍。喷施BV使Cd8处理下对羟基苯甲酸和咖啡酸的质量分数变化较大，分别为未喷施的2.2倍和2.5倍。其中含量较高的绿原酸和苯甲酸，在Cd8处理下，喷施BV分别为未喷施的1.9倍和1.8倍。此外，原儿茶酸在喷施BV后也有不同程度的增加。

2.3.2 根和叶中结合态酚酸含量

叶中检测到12种结合态酚酸，各酚酸含量表现为对香豆酸>咖啡酸>绿原酸>阿魏酸>对羟基苯甲酸>苯甲酸>没食子酸>异绿原酸A>原儿茶酸>丁香酸>香兰素>肉桂酸（表4）；根中检测到11种结合态酚酸，各酚酸含量表现为咖啡酸>绿原酸>丁香酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>没食子酸>苯甲酸>阿魏酸>原儿茶酸>香豆素>香兰素（表5）。且结合态酚酸总量表现为叶<根。

表4 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd处理下紫苏叶中结合态酚酸含量影响Table 4 Effects of BV spray on the content of bound phenolic acid in Perilla frutescens leaves treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd

表5 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd处理下紫苏根中结合态酚酸含量影响Table 5 Effects of BV spray on the content of binding phenolic acid in Perilla frutescens root treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd

如表4所示，在未喷施BV时，Cd0、Cd4和Cd8处理下叶中结合态酚酸质量分数分别为304、427、631 μg·g-1。喷施BV较未喷施相比，Cd0和Cd4处理下叶中结合态酚酸质量分数分别显著增加了35.1%（P<0.001）和28.2%（P<0.001），而Cd8处理无显著差异。在所有被检测的叶中结合态酚酸，Cd处理下均有不同程度的改变，以Cd8处理下原儿茶酸、咖啡酸和丁香酸的质量分数变化较大，分别为Cd0的3.3、3.3和3.2倍。喷施BV导致Cd4处理下原儿茶酸的质量分数变化较大，为未喷施的2.3倍。其中含量较高的对香豆酸、咖啡酸和绿原酸，在Cd4处理下，喷施BV分别为未喷施的1.1、1.7和1.2倍。

如表5所示，在未喷施BV时，Cd0、Cd4和Cd8处理下根中结合态酚酸质量分数分别为314、307、363 μg·g-1。喷施BV较未喷施相比，Cd0处理下根中结合态酚酸质量分数显著降低了53.9%（P<0.001），Cd4和Cd8处理下根中结合态酚酸质量分数分别显著增加了21.5%（P<0.001）和16.5%（P<0.001）。在所有被检测的根中结合态酚酸，Cd处理下以Cd8处理的香兰素质量分数增加较大，为Cd0的1.9倍。喷施BV导致Cd4处理下阿魏酸的质量分数变化较大，为未喷施的2.2倍。其中含量较高的对咖啡酸和绿原酸，在Cd4处理下，喷施BV分别为未喷施的1.5倍和1.2倍。喷施BV使Cd4和Cd8处理下苯甲酸和原儿茶酸也有不同程度的提高。

紫苏叶中以及根中的可溶性酚酸和结合态酚酸含量也表现出不同的差异。在自然生长下，叶表现为可溶性酚酸含量大于结合态酚酸含量，而根中二者的含量相反。在Cd和BV处理后，叶以及根中两种形态酚酸的相对含量并未改变。较未喷施BV相比，可溶性酚酸含量以喷施后Cd4处理下的叶和Cd8处理下的根中增加较多，结合态酚酸含量也有不同程度的提高，但相对增加量为可溶性酚酸含量更大，表明喷施BV可以增加Cd处理下可溶性和结合态酚酸含量，且以可溶性酚酸含量为主。值得注意的是，没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸主要以结合态的形式存在于植物体，异绿原酸A、苯甲酸和迷迭香酸主要以可溶性的形式存在于植物体，酚酸形态的不同在植物体所执行的功能也不同。

2.4 竹醋液对不同Cd浓度处理下植株抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

2.4.1 叶中抗氧化酶活性和丙二醛含量

如图4所示，未喷施BV时，较Cd0相比，Cd4处理下叶CAT酶活性显著增加了86.7%（P<0.001），Cd8处理下叶SOD酶活性显著增加了11.1%（P=0.002），而Cd处理下的POD和APX酶活性均不同程度的降低。Cd4和Cd8处理均导致叶中MDA含量增加，较Cd0分别显著增加19.6%和27.2%（P<0.001）；喷施BV较未喷施相比，在Cd0处理下，叶中POD酶活性显著降低22.3%（P<0.001），APX酶活性显著增加63.3%（P<0.001）。在Cd4处理下，叶中POD和SOD酶活性分别显著增加10.9%（P=0.036）和11.6%（P=0.004），CAT酶活性显著降低57.1%（P<0.001）。在Cd8处理下，叶中POD和APX酶活性分别显著增加31.2%（P=0.001）和414.1%（P=0.002），SOD酶活性显著降低6.5%（P=0.024）。喷施BV使Cd0处理下MDA含量显著降低了18.7%（P<0.001），Cd4处理下MDA含量显著增加了20.7%（P<0.001），而Cd8处理下无显著差异。

图4 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd浓度处理下紫苏叶中PDD活性（a）、CAT活性（b）、SOD活性（c）、APX活性（d）和MDA含量（e）的影响Figure 4 Effects of BV spray on PDD activity (a),CAT activity (b),SOD activity (c),APX activity (d)and MDA content (e) in Perilla frutescens leaves treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations

2.4.2 根中抗氧化酶活性和丙二醛含量

如图5所示，未喷施BV时，Cd处理下根中POD、SOD、CAT和APX酶活性均不同程度的降低，MDA含量在Cd4和Cd8处理下较Cd0分别显著增加了62.0%（P<0.001）和59.4%（P<0.001）；喷施BV较未喷施相比，在Cd0处理下，根中POD和SOD酶活性分别显著降低了24.0%（P<0.001）和43.5%（P<0.001），APX酶活性显著增加了47.4%（P<0.001）。在Cd4和Cd8处理下POD、SOD和APX酶活性均不同程度的增加，Cd4处理下分别显著增加了64.2%（P=0.036）、32.6%（P<0.001）和67.0%（P<0.001），Cd8处理下分别显著增加了65.1%（P=0.001）、26.7%（P<0.001）和76.0%（P=0.029）。喷施BV使Cd0处理下MDA含量显著增加了19.3%（P=0.003）的，而Cd4和Cd8处理下MDA含量分别显著降低了10.6%（P=0.006）和8.62%（P=0.019）。

图5 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd浓度处理下紫苏根中PDD活性（a）、CAT活性（b）、SOD活性（c）、APX活性（d）和MDA含量（e）的影响Figure 5 Effects of BV spray on PDD activity (a),CAT activity (b),SOD activity (c),APX activity (d)and MDA content (e) in Perilla frutescens root treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations

2.5 竹醋液对不同Cd浓度处理下植株酶系统和非酶系统的影响

如图6a所示，前两个主成分解释了总方差的87.5%，其中PC1的贡献为66.0%。说明Cd和BV处理改变了叶中这些指标的含量。在UBVCd0、BVCd0和UBVCd4处理下，POD、APX和CAT酶活性是酶系统的特征信号，在分离过程中起着至关重要的作用。而UBVCd8和BVCd8处理下，类黄酮和酚酸非酶系统负责这种分离。

图6 喷施BV对0、4 mg∙L-1和8 mg∙L-1 Cd浓度处理下紫苏酶系统和非酶系统的主成分分析（PCA）得分图Figure 6 Principal component analysis (PCA) scores of enzymatic and non-enzymatic systems of Perilla frutescens at 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations treated with BV

如图6b所示，前两个主成分解释了总方差的的76.7%，其中PC1的贡献为44.7%，而PC2的贡献为32.0%。6个处理均在前两个主成分中成功分离。表明BV和Cd处理均对紫苏根系中所研究的性状有显著的影响。酶系统SOD、POD、APX和CAT以及非酶系统酚酸和类黄酮均在两个主成分中成功分散。

2.6 酚酸、类黄酮与Cd富集指标的相关性分析

如图7所示，叶中结合态酚酸与BCF、TF呈现显著负相关（P<0.05），r分别为-0.64和-0.84。根中可溶性酚酸、结合态酚酸和总酚酸与TF呈现显著负相关（P<0.05），r分别为为-0.81、-0.66和-0.75。

图7 采用皮尔逊相关系数来确定紫苏根和叶中重金属与酚酸和类黄酮含量之间的关系Figure 7 Pearson correlation coefficient was used to determine the relationship between heavy metals and phenolic acids and flavonoids contents in Perilla frutescens roots and leaves

叶中结合态酚酸与地上部Cd含量呈现显著负相关（P<0.05），r= -0.65。根中可溶性酚酸、结合态酚酸和总酚酸与地下部Cd含量呈现显著正相关（P<0.05），分别为r=0.98、0.85和0.94。根中类黄酮与地下部Cd含量呈现显著负相关（P<0.05），r=-0.81。

3 讨论

植物暴露于过量的Cd胁迫下会导致生物量的损失，而植物生物量是评价植物修复效率的重要指标之一（Liu et al.，2019）。BCF是衡量植物对元素的吸收和贮藏能力，TF是判断植物元素由地下部转运至地上部的效率。Cd由根系进入植物细胞中，一部分被根系细胞壁钝化以及储存于细胞的液泡中，一部分通过木质部转运至地上部。本研究结果表明，BV可以提高Cd胁迫下紫苏生物量、地下部和地上部Cd含量，提高紫苏的Cd富集量。BV在一定程度上缓解了Cd对紫苏的生长抑制作用，这与吴苗苗（2022）以黑麦草为植物修复材料中得出的结果相似。BV提高了紫苏BCF，而降低了8 mg·L-1Cd胁迫下紫苏TF，表明根系在高Cd胁迫下的重要作用。前人已证明龙葵是一种Cd的超富集植物（Zhang et al.，2011），而杨春燕（2020）研究结果显示，3种不同品种的Cd超富集植物龙葵，均为TF<1。本研究结果中TF<1，这可能与环境的选择有关。此外，种子来源、Cd处理浓度以及培养条件均会导致结果不同。

Cd在植物体的细胞壁和液泡等非活性部位的分布，对植物产生较弱的毒性作用。游离于细胞质或其他功能细胞器时，表现为剧烈的细胞毒性，会导致细胞功能异常或丧失，而体内活性氧（ROS）的过度产生是金属胁迫进而损伤细胞的重要标志之一。植物细胞中存在的抗氧化酶可清除过量ROS，降低膜脂氧化损伤程度，从而使植物维持正常生理活动。其中SOD酶可以清除O2-，POD、CAT和APX酶可以清除H2O2，而MDA含量是衡量膜脂氧化损伤程度的重要指标（林琳等，2022）。本研究中，Cd胁迫导致紫苏抗氧化酶活性降低，MDA含量增加，这与谢惠玲等（2011）对不同浓度Cd胁迫下紫苏的抗氧酶活性研究结果相似。通过喷施BV，Cd胁迫下根系抗氧化酶活性增加，尤其对APX酶活性的改善，导致Cd胁迫下膜脂氧化损伤程度降低。表明BV对Cd胁迫下植物抗氧化酶系统的改善，缓解植物细胞氧化损伤。

酚类化合物含量在Cd胁迫下有明显的响应，酚类化合物合成的增加，通常表现出对逆境更好的适应性（Sharma et al.，2019）。酚类代谢物参与由胁迫因素产生的ROS的清除，具有相当强的抗氧化性能（Sgherri et al.，2003）。植物酚类化合物含量在Cd胁迫下的显著提高（Wang et al.，2020），表明它们在重金属耐受性中的重要性（Küpper et al.，2004）。本试验中，不同浓度Cd胁迫下叶和根中总类黄酮和总酚酸含量均有不同程度的响应。Kovácik et al.（2008）以甘菊为植物材料，证明了酚酸类化合物在Cd胁迫中起到重要的抗氧化作用。本研究中酚类物质含量的提高，表明BV对Cd胁迫下植物抗氧化作用的改善，更多的酚类物质为植物提供更加强大的金属防御能力，从而缓解植物损伤。

越来越多的证据表明，酚酸在植物应对金属胁迫的重要性。拥有清除ROS和作为金属螯合剂的双重作用（Vasconcelos et al.，1999），其在细胞壁的酯化，对细胞壁的金属防御起到重要作用（De Ascensao et al.，2003）。例如，绿原酸和咖啡酸是植物中重要的抗氧化剂，可防止脂质过氧化（Niggeweg et al.，2004），而原儿茶酸是一种具有高螯合强度的苯酚（Irtelli et al.，2006），丁香酸比对羟基苯甲酸更有活性（Razal et al.，1996）。在本研究中，所有这些化合物均被检测到，尤其叶中的可溶性酚酸，更为丰富。BV的施加，使得Cd胁迫下可溶性和结合态酚酸含量增加，其中可溶性酚酸含量增加更多。表明施加BV可以同时提高金属胁迫下由酚酸类化合物提供的植株抗氧化和金属固化的双重能力。我们观察到，BV处理使Cd胁迫下植物体的没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、和苯甲酸含量增加，并加速酯化为结合态酚酸，为植株提供了更强的金属防御能力。研究表明，根系细胞壁中Cd的含量大于叶（Tian et al.，2011），将有毒的金属离子固定在植物的非活性部位－细胞壁，尤其是根系，似乎是更有效的。相关性分析表明，根系中可溶性、结合态和总酚酸含量均与地下部Cd含量呈显著正相关（P<0.05），与TF呈显著负相关（P<0.05），表明酚酸在根系金属防御的重要性。植物叶以可溶性酚酸为主，而根以结合态酚酸为主，这与植物不同器官的功能差异有关。我们猜测，根中高比例的结合态酚酸可能在细胞壁的固定中发挥重要作用。根系中大部分酚酸特异性或非特异性地酯化在细胞壁中，并且可能在根系抵抗应激源中发挥重要作用。

酶系统和非酶系统在应对金属胁迫引起的氧化损伤起到及其重要的作用，研究植物酶系统和非酶系统对金属胁迫的响应机制，对探究BV增强紫苏Cd富集能力至关重要。本研究结果表明，未喷施BV时，叶和根系以高Cd胁迫下的膜脂氧化损伤更大（图6），这与Chen et al.（2020）的主成分分析结果相似。而喷施BV引起了不同Cd浓度胁迫下叶和根系的损伤差异。在低Cd胁迫下，叶中以CAT、POD和APX酶系统发挥主导作用。在高Cd胁迫下，叶中以酚酸和类黄酮等非酶系统发挥主导作用。而根中各Cd浓度胁迫引起的差异是酶系统和非酶系统共同作用的结果。通过施加BV，引起各浓度Cd胁迫下叶和根系中各指标的差异，且低Cd胁迫下叶的差异更大。造成这种现象的原因是植物在低Cd胁迫下生理组织未受到严重破坏，抗氧化酶活性的提高可以抵抗不利环境，而在高Cd胁迫下，抗氧化酶活系统对ROS的去除无法满足植物的生长需要，此时非酶系统发挥关键作用（Pan et al.，2021）。在高Cd胁迫下，喷施BV对叶和根系各指标的差异不显著，表明BV对高Cd胁迫下的毒性缓解作用较弱，这可能由于高Cd胁迫下植物的生理已经受到严重的损害，BV无法逆转植物的组织损伤。

综上所述，随Cd浓度的升高，紫苏POD和APX酶活性下降，酶系统受到一定程度的损伤，MDA含量增加，导致生物量下降。在Cd胁迫条件下，喷施BV提高了POD、APX酶活性以及类黄酮和酚酸类物质含量，降低了MDA含量，表明喷施BV可以通过增强紫苏的抗氧化系统来缓解Cd胁迫，以保证紫苏的正常生理活动。此外，主成分分析结果表明，BV可以改善低镉胁迫下紫苏的酶系统和非酶系统来增加植物对逆境环境的适应性，而对高Cd胁迫下植物生理损伤，BV的影响效果较小。