纳米银对玉米幼苗傅里叶红外光谱特性的影响

赵海英，刘致远，袁梦仙，张卿雯，张琼，曹际玲*

1.通化师范学院历史与地理学院，吉林 通化 134001；2.江西农业大学国土资源与环境学院/江西省鄱阳湖流域农业资源与生态重点实验室，江西 南昌 330045

纳米银是指三维空间至少有一维处于1－100 nm的金属银单质。由于其优异的抗菌性能和独特的催化及超导性能，被广泛应用于医疗、食品、纺织品、涂料及农业等多个领域，据统计纳米银已应用于全球近300种不同类型的产品（Marchi et al.，2019；Zhao et al.，2021）。纳米银产品的大量生产和使用，使其不可避免地进入环境中。纳米银可通过污泥、地表水、农药喷施和灌溉等不同途径进入土壤，对植物生长产生一定的威胁（Madanayake et al.，2022）。已有研究发现一定浓度纳米银可引起植物光合色素分解、抑制光合作用、降低对营养元素的吸收，进而导致植物生物量下降（Falco et al.，2020）。还有研究发现纳米银使作物结实率降低，影响籽粒品质，降低精氨酸和组氨酸的比例（Yang et al.，2018；Yan et al.，2022）。纳米银还可进入植物体内并累积，从而通过食物链对动物和人体健康造成潜在危害（彭小凤等，2014）。因此，纳米材料暴露的植物生物效应引起广泛关注。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）是一种基于有机物分子中极性键振动分析物质组成和含量的技术，通过吸收峰的高低以及在不同波数吸收峰的走向，准确分析有机物分子的种类、结构及含量的高低。由于它的灵敏度高、操作安全性高、测试方法简便且时间短等优点，傅里叶变换红外光谱已被广泛应用于研究不同环境有机物组成结构和含量响应（胡立新等，2021）。例如，夏镇卿等（2020）研究发现增温胁迫下玉米植株内源物质合成受阻，植株多糖、脂类含量下降。还有研究发现高硼胁迫改变了砧木蛋白质和可溶性糖的结构降低了其含量（卢晓佩等，2017）。付川等（2014）研究紫花苜蓿对铜胁迫的生理响应，发现植物化学组分和含量的变化有助于揭示其铜耐性机理，紫花苜蓿可分泌有机酸和提高油脂化合物含量将吸收的铜大部分积累在根部，阻止铜向植物地上部分运输，有效地保护植物地上部分。还有研究发现铅胁迫下博落回植株细胞内羧基和羟基等基团和有机酸、蛋白质含量增加，可鳌合与固定铅，降低铅对博落回的毒性效应（蔡斌等，2021）。铜胁迫下沙田柚根系果胶、纤维素和蛋白质等物质含量增加，有助于吸附和固定铜，降低铜的毒害作用（李欣钰等，2022）。镉胁迫下龙葵根系羧基和羟基等有机物含量的增加有助于吸附镉降低镉毒害（Wang et al.，2020）。Zuverza-Mena et al.（2016）研究发现纳米银改变了萝卜植株根系和叶片脂肪酸、蛋白质和木质素、纤维素等细胞结构物质含量进而影响植株生长。还有研究发现纳米银增加了黄瓜幼苗酚类化合物含量以抵抗纳米银的氧化胁迫（Zhang et al.，2018）。然而，目前纳米银暴露对玉米植株有机物质组分和结构的影响研究还尚少。

玉米是中国重要的粮食作物之一，是人类和畜禽的重要食物来源，也是重要的工业原料。本研究以玉米为供试植物，以纳米银为供试材料，在盆栽条件下模拟不同纳米银污染水平的土壤，采用傅里叶变换红外光谱分析玉米幼苗叶片和根系的红外光谱特征，根据吸收峰的变化探究不同浓度纳米银对玉米幼苗叶片和根系主要代谢物的影响，并结合玉米幼苗生长情况，探究纳米银对玉米幼苗生长的作用机理，为系统评价纳米材料的环境生态效应和纳米产品的安全使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试盆栽土壤采自河南封丘的中国科学院实验站内的农田，土壤类型为华北平原典型潮土，作物种植模式为冬小麦-夏玉米轮作。小麦成熟后玉米种植前，采集耕层土壤，风干后去除石块、植物残体等，过2 mm筛备用。供试纳米银购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，平均粒径约15 nm，纯度为99.8%。

1.2 试验设计

参照纳米银生态效应研究（He et al.，2022；Noori et al.，2017），设置3个纳米银施加浓度：1.0 mg·kg-1（L）、5.0 mg·kg-1（M）、10.0 mg·kg-1（H），以不施加纳米银（0 mg·kg-1）为对照，每个处理3次重复。称取过筛土壤200 g，根据不同施加浓度，将相应量纳米银分别加入到相同体积的双蒸水中，混合均匀后逐滴加入到土壤表面。选取形态相近的玉米种子，首先用0.5%次氯酸钠将玉米种子表面消毒，再放入恒温培养箱中催芽2 d。选择已发芽的玉米种子播种在土壤表层下0.5 cm左右，每盆播种2颗。盆栽试验在日光温室进行，不同处理盆栽随机摆放并定期交换调整位置，定期浇水且每盆浇相同水量，每周每盆浇灌15 mL营养液。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 玉米植株生物量的测定

待玉米种植30 d，将植物地上部分和地下部分分别收获，取新鲜根系和叶片称鲜重后用于测定扫描电镜，其余部分称鲜重后烘干对玉米幼苗的地上部和地下部称重，并计算得到地上部和地下部干重。植物地上部和地下部烘干后分别磨碎过0.15 mm筛孔，用于测定FTIR。

1.3.2 玉米植株傅里叶红外光谱测定

称取2 mg根系和叶片样品，溴化钾200 mg，将两者混合后研磨均匀，粉末样品与溴化钾粉末以1:100（质量比）的比例放入玛瑙研钵中搅磨均匀并压片，置于傅里叶红外光谱仪（Nicolet iS50,Thermo，美国）选用DTGS检测器测定光谱特性。扫描范围为4000－400 cm-1，分辨率为2 cm-1，扫描次数为64次。测试时环境条件：相对湿度为65%±2%，温度为 (24±1) ℃。

1.4 数据处理

采用Excel 2007软件计算数据平均值和标准偏差。利用SPSS 18.0进行单因素方差分析，并对同一处理3个重复的光谱数据进行相关分析，相关系数大于0.99，表明光谱重复性较好。采用Omnic 8.0软件对FTIR图谱数据进行处理，将透射率数据转换为吸光度后，进行基线校正，并以根系（叶片）最高吸光度为标准，对光谱数据进行极差标准归一化处理，以提高不同纳米银浓度处理间光谱数据的可比性，最后通过光谱吸收峰相对吸光度的变化分析纳米银对玉米植株有机物质含量的影响。采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 纳米银对玉米幼苗生长的影响

不同浓度纳米银对玉米幼苗地上部和地下部生物量产生了不同程度的影响（图1）。与对照处理相比，随着纳米银施加浓度的增加，玉米幼苗地上部和地下部生物量呈下降趋势，高浓度纳米银处理下玉米幼苗地上部和地下部生物量显著（P<0.05）下降，降幅分别达16.5%和22.2%，可见纳米银对玉米幼苗地下部的影响程度大于地上部。

图1 不同浓度纳米银处理下玉米幼苗地上部和地下部生物量Figure 1 Shoot dry biomass and root dry biomass of maize seedlings under different concentrations of AgNPs

2.2 纳米银对玉米幼苗根部红外光谱特性的影响

FTIR图谱能够反映出物质所含的官能团的种类，不同吸收峰波数代表不同的化学成分官能团种类（表1）。通过FTIR测定发现不同浓度纳米银处理下玉米根系的各化学官能团的吸收处于波数4000－400 cm-1的中红外区（图2）。

表1 红外光谱中有机物、官能团及其对应的FTIR特征波长Table 1 Main organic matter,functional groups and their corresponding FTIR characteristic wavelengths

图2 不同浓度纳米银处理下玉米幼苗根系的傅里叶红外光谱特征（4000－400 cm-1）Figure 2 FTIR spectra of the roots of maize seedlings under different concentration of AgNPs(4000-400 cm–1)

由图2可以看出，不同浓度纳米银处理下玉米幼苗根系光谱均有典型的共有特征吸收峰，但各处理间在4000－400 cm-1波数范围内特征吸收峰位置和吸光度大小存在差异。低中浓度纳米银（1.0、5.0 mg·kg-1）处理下特征峰相对吸光度高于对照处理，高浓度纳米银（10.0 mg·kg-1）处理下特征峰的相对吸光度明显低于对照处理，表明不同浓度纳米银处理下玉米根系有机物组分组成和含量发生了不同程度的改变。波数3405 cm-1附近的特征峰是碳水化合物羟基O-H和N-H伸缩振动引起的。对照处理下玉米根系中该吸收峰位于3405 cm-1，低、中浓度纳米银处理下，玉米根系中该吸收峰位于3396 cm-1和3400 cm-1向低频方向分别发生了9 cm-1和5 cm-1的位移，且相对吸光度明显高于对照，而高浓度纳米银下玉米根系该吸收峰的位移变化较小（表2），相对吸光度降低，说明低中浓度纳米银影响了玉米根系中氢键的结合，改变碳水化合物的结构，增加碳水化合物含量，高浓度纳米银未改变碳水化合物的结构但降低了其含量。2925 cm-1附近的吸收峰是脂类化合物中饱和-CH2中的C-H和有机酸类物质的羧酸羧基O-H的伸缩振动产生。与对照处理相比，无论低浓度纳米银还是高浓度纳米银处理下2925 cm-1吸收峰的位置均变化较小，但低中浓度纳米银下该吸收峰的相对吸光度明显增加，高浓度纳米银处理下相对吸光度降低，表明纳米银对玉米根系脂类化合物的结构未产生显著影响，但改变了其含量。此外，在1800－800 cm-1波数范围内特征吸收峰较集中且处理间变化明显，为提高FTIR谱图分辨率更好解析有机物的变化规律，进一步分析不同处理下1800－800 cm-1范围内的FTIR谱图（图3）。

表2 不同浓度纳米银处理下玉米根系特征吸收峰波数Table 2 Characteristic peak wave number of FTIR in maize root under different concentration of AgNPs

图3 不同浓度纳米银处理下玉米幼苗根系的傅里叶红外光谱图（1800－800 cm-1）Figure 3 FTIR spectra of the roots of maize seedlings under different concentration of AgNPs(1800-800 cm-1)

由图3可以看出，与对照处理相比，纳米银处理下玉米根系在1800－800 cm-1范围内的吸收峰数量和位置无显著变化，但相对吸光度发生了明显变化，意味着纳米银对1800－800 cm-1范围内根系有机物质结构影响较小，但改变了根系有机物质含量。低、中浓度纳米银（1.0、5.0 mg·kg-1）下特征吸收峰吸光度明显增加，而高浓度纳米银（10.0 mg·kg-1）下吸收峰相对吸光度一定程度的降低。由此可见，低、中浓度纳米银胁迫下根系蛋白质、可溶性糖、纤维素、果胶、酯类等有机大分子物质结构未发生改变，但其含量明显增多，这可能是低中浓度纳米银胁迫下根系受到氧化胁迫，大分子物质的增多可用于抵抗纳米银胁迫，而在高浓度纳米银胁迫下植物生长发育受到抑制，合成的有机物质减少。1637、1559、1256 cm-1波数左右的特征峰表示蛋白质酰胺І、Ⅱ、Ⅲ带，其吸光度随纳米银浓度升高先升高后降低，高浓度纳米银胁迫下玉米根系蛋白质含量减低。在波数1039 cm-1附近的特征峰表征糖类碳水化合物，其吸光度变化幅度较大，表明纳米银对糖类碳水化合物含量的影响较大。

2.3 纳米银对玉米幼苗叶片红外光谱特性的影响

FTIR图谱显示不同浓度纳米银处理下玉米叶片的各有机分子的吸收峰位于中红外区，即波数4000－400 cm-1范围内（图4）。不同处理间的叶片谱图均包含典型共有吸收峰，但特征峰数目和相对吸光度大小发生了不同程度的变化。低浓度纳米银处理下4000－1500 cm-1波数时特征峰的相对吸光度高于对照处理，在波数1500－800 cm-1附近特征峰的相对吸光度低于对照处理低浓度纳米银叶片吸收峰吸光度变化较小，中、高浓度纳米银条件下叶片4000－400 cm-1波数范围特征峰的相对吸光度明显低于对照处理。结合表3进一步分析发现，3405 cm-1波数附近的特征峰在低浓度纳米银处理下该吸收峰向高频方向发生了10 cm-1的位移，而中、高浓度纳米银下玉米根系该吸收峰的位移变化较小（表3）。低浓度纳米银处理下1559 cm-1，1517 cm-1处的吸收峰缺失，高浓度纳米银下1517 cm-1的吸收峰缺失，并且1633 cm-1处的吸收峰向高频方向位移了14 cm-1，其他吸收峰位置变化较小。由此可见，纳米银处理下玉米叶片物质结构和含量发生了不同程度的改变。波数1800－400 cm-1范围内特征峰数量集中，为减少叠加更高分辨率解析FTIR谱图，对该范围内进一步分析谱图（图5）。

表3 不同浓度纳米银处理下玉米叶片特征吸收峰波数Table 3 Characteristic peak wave number of FTIR in maize leaves under different concentration of AgNPs

图4 不同浓度纳米银处理下玉米幼苗叶片的傅里叶红外光谱图（4000－400 cm-1）Figure 4 FTIR spectra of the leaves of maize seedlings under different concentration of AgNPs(4000-400 cm-1)

图5 不同浓度纳米银处理下玉米幼苗叶片的傅里叶红外光谱图（1800－800 cm-1）Figure 5 FTIR spectra of the leaves of maize seedlings under different concentration of AgNPs(1800-800 cm-1)

由图5可以看出，与对照处理相比，低浓度纳米银下1559、1517、1490 cm-1处的吸收峰缺失，1559、1517、1490 cm-1吸收峰分布代表蛋白质酰胺II带、酚类物质的苯环骨架振动吸收及细胞壁多糖中碳氢键发生不对称变形表明低浓度纳米银破坏了酰胺II带、酚类物质的化学结构、叶片细胞的细胞壁中多糖类物质。高浓度纳米银下1517 cm-1的吸收峰缺失，且1633 cm-1处的吸收峰向高频方向位移了14 cm-1，其他吸收峰位置变化较小，表明高浓度纳米银改变了酚类物质和蛋白质酰胺I带结构。从特征峰吸光度来看，1633 cm-1处的吸收峰吸光度在中高浓度纳米银下明显降低，且高浓度纳米银的降幅更大，说明高浓度降低了蛋白质含量。此外1600－400 cm-1范围内的1384、1258、1202、1160、1104和1056 cm-1特征峰吸光度均随着纳米银浓度的增加而下降，意味着纳米银胁迫显著降低了膜和胞壁含油脂化合物、核酸、蛋白质分子氨基酸残基、纤维素糖苷和多糖、果胶类等物质含量。而在低浓度纳米银下3405、1633 cm-1波数特征峰吸光度高于对照，说明低浓度纳米银增加了叶片碳水化合物和蛋白质含量。

3 讨论

纳米银的尺寸效应和银离子的强氧化性对植物生长和代谢产生一定程度的胁迫或抑制作用，且影响程度与纳米银浓度密切相关（黄德超等，2016）。本研究发现低浓度纳米银（1.0 mg·kg-1）对玉米幼苗生长的影响较小，但随着纳米银浓度的增加玉米幼苗生物量呈下降趋势，高浓度纳米银（10.0 mg·kg-1）显著抑制了玉米幼苗生长，这与以往的研究结果类似（Zhang et al.，2020；王荣等，2015）。例如，Linares et al.（2020）研究发现纳米银（3.9－394 mg·kg-1）对大麦幼苗生长的影响表现为浓度剂量效应，随着纳米银浓度的增加，大麦幼苗地上部和地下部生物量的降幅均显著增加。还有研究发现10.0 mg·kg-1的纳米银未对黑麦草生长产生明显影响，但20－200 mg·kg-1纳米银显著抑制了植物生长（王荣等，2015）。因此，同一浓度纳米银在不同条件下对不同植物生长的影响不同，这表明纳米银的植物生物效应不仅与其浓度有关，还受其他因素的影响。已有研究证实土壤有机质、矿物组分等可影响纳米银在土壤中的有效性进而改变纳米银的植物生物效应（Wang et al.，2015）。例如，土壤有机质可吸附和固定纳米材料，有机质含量不同的土壤纳米材料的生物毒性效应也不同（Ge et al.，2014；Watson et al.，2015）。此外，还有一些研究发现高浓度纳米银抑制植物生长，低浓度纳米银促进了植物生长（Acharya et al.，2020；Yan et al.，2022）。目前大量研究证实纳米银可进入植物体内产生氧化胁迫进而抑制植物生长（Madanayake et al.，2022；Xu et al.，2020），但低浓度纳米银促进植物生长的机制尚不清楚。这种“低促高抑”的现象类似于重金属污染的hormesis效应，即低剂量胁迫对生物体的刺激作用，也是生物体对胁迫的过激响应（Calabrese et al.，2003）。研究发现，纳米银胁迫可促进活性氧的产生，一定量的活性氧可作为信号分子和信号转导通道诱导植物抗性途径进而促进植物生长（Tripathy et al.，2012；Yan et al.，2022）。低浓度纳米银还可能通过促进植物有益细菌的生长，提高土壤碳氮循环进而间接促进植物生长（Yan et al.，2022）。随着纳米银浓度的增加，活性氧产生量增加，植物抗性系统不能够清除活性氧，进而产生氧化胁迫抑制植物生长（Qian et al.，2013）。

植物体内有机物质是植物生长和代谢的主要能量来源，其在植物体内组成和含量的变化能反映植物的生理状况，也能反映植物对环境变化的动态响应。本研究通过FTIR技术分析植物代谢物对纳米银胁迫的响应，发现低浓度纳米银导致植物根系羟基、羧基等官能团和脂类化合物、碳水化合物、可溶性糖和蛋白质等有机物含量增加。羟基和羧基等官能团能与金属离子结合，其含量的增加可固定纳米银从而降低其植物的毒性作用（Meychik et al.，2014；Jia et al.，2019）。重金属胁迫下的研究利用FTIR技术也发现重金属胁迫增加了植物体内羟基和羧基含量，进而降低重金属对植物的胁迫作用（Wang et al.，2020；蔡斌等，2021）。此外，可溶性糖是植物光合作用的同化产物，同时也是重要的渗透调节物质，在逆境胁迫中发挥着重要作用（Imaji et al.，2010）。近年来有研究发现在氧化胁迫下植物通过促进可溶性糖的合成来调节渗透压，抵抗氧化胁迫（周慧敏等，2019）。Zhang et al.（2018）研究发现纳米银增加了植物酚类化合物含量以抵抗纳米银的氧化胁迫。基于蛋白质组学的研究也发现纳米银处理下植物可通过调节有机物质代谢循环为细胞提供能量以响应纳米银胁迫（Jhanzab et al.，2019；Mustafa et al.，2015）。但低浓度纳米银处理下植物叶片代谢物含量的变化程度较地下部分小，这可能是由于土壤中纳米银直接与植物根系作用，吸附在植物根系表面、进入根系细胞，再从根系进入植物地上部分，对植物地下部分的作用更大（Dimkpa et al.，2015）。无论植物根系还是叶片，高浓度纳米银处理下由于胁迫程度的增大植物代谢物吸收峰吸光度均下降，表明高浓度纳米银抑制了植物地上部和地下部有机物合成。这与纳米银处理下萝卜植株脂肪酸和碳水化合物等有机物质的变化趋势一致，这些有机分子含量的下降和组成的变化将不利于植物生长发育，导致生物量降低（Zuverza-Mena et al.，2016）。基于光合参数的测定证实高浓度纳米银抑制了植物光合作用和二氧化碳同化，进而影响碳水化合物的合成（Falco et al.，2020）。还有研究发现纳米银处理下植物氮同化基因表达水平下调，抑制蛋白质的合成（Das et al.，2018）。高硼胁迫下的研究也发现植物碳水化合物和蛋白质的含量下降（卢晓佩等，2017）。

4 结论

通过盆栽试验模拟不同纳米银污染水平的土壤，发现低浓度（1.0、5.0 mg·kg-1）纳米银对玉米幼苗生物量的影响较小，高浓度（10.0 mg·kg-1）的纳米银可对玉米幼苗产生一定的毒性效应，降低了玉米幼苗地上部和地下部生物量。低浓度纳米银增加了玉米幼苗根系羧基、羟基等官能团、有机酸、蛋白质和碳水化合物等有机物质含量，可能是纳米银胁迫下玉米通过调节蛋白质、碳水化合物等有机物含量抵抗纳米银的胁迫作用，从而降低纳米银对玉米幼苗生长的影响。高浓度纳米银对玉米幼苗根系和叶片的胁迫作用增大，降低了玉米幼苗根系和叶片蛋白质、碳水化合物和脂质等有机物质含量，抑制了玉米幼苗生长。本研究结果有助于深入认识纳米材料的植物生物效应，为纳米材料对植物生长和生理代谢作用机理的阐释提供依据。