PM2.5对HUVEC毒性及对ROS、MDA、LDH水平影响

嵇志刚 李天来 徐艺 王甜

细颗粒物(PM2.5)指空气动力学直径≤2.5 μm颗粒物,是雾霾重要组成成分,可长时间悬浮于空气中,对环境质量和人体健康等可造成严重危害,有研究显示PM2.5暴露与人群疾病死亡率、发病率以及住院率增加密切相关[1,2],且PM2.5每升高10 μg/m3,呼吸和心脑血管入院风险分别增加0.640%、0.697%,WHO在2005年制定PM2.5的准则值,其年均值为10 μg/m3,日均值为25 μg/m3,我国在2012年将PM2.5纳入空气检测指标,规定日均值为75 μg/m3,年均值为35 μg/m3(GB3095-2012),并且建立相应检测点[3]。PM2.5具有粒径小、表面积大的特点,其表面吸附了大量有机化学物质、重金属和病原微生物等,同时因为在大气中滞留时间长、输送距离远,被人体吸入的机会多,并且可以随呼吸至下呼吸道,其中0.1 μm的颗粒物可以通过气血屏障进入血液循环,对人体健康可以产生严重危害,随着我国工业化进程的发展,PM2.5为主要成分的空气污染已经成了影响人们健康主要原因,主要危害存在于呼吸系统和心血管系统等慢性疾病方面[4,5]。本文通过不同浓度的PM2.5染毒人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察PM2.5毒性,报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验试剂:HUVEC来源西安交通大学口腔医院惠赠;实验试剂:Tefion滤膜(购自北京海成世洁过滤器材有限公司)、RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS,美国Hyclone公司)、胰蛋白酶(美国Genview公司)、双抗(北京爱普华美生物科技有限公司)、DMSO(购自西安国安生物科技有限公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT,美国Amresco公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC,德国Sigma公司)、微量丙二醛(MDA)测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)、乳酸脱氢酶(LDH)测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)、活性氧(ROS)测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)、MMP检测试剂盒(JC-1)(碧云天)、Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(南京建成生物工程研究所)。(2)实验设备:KB-120F型智能TSP-PM2.5中流量采样器(青岛金仕达电子科技有限公司)、HEPA CO2培养箱(美国,Thermo Forma 公司)、透气培养瓶(加拿大,LabServ公司)、96孔板(加拿大,LabServ公司)、24孔板(加拿大,LabServ公司)、6孔板(加拿大,LabServ公司)、细胞计数板(上海化科实验器材有限公司)、Infinite M200酶标仪(瑞士,TECAN公司)、倒置显微镜(日本,OLYMPUS公司)、流式细胞仪(BD FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5样品采集和处理:采样前将Teflon滤膜干燥平衡24 h,然后称量(ml),按照采样规范在约离地面21 m处进行采集,连续采集14 h,采样时详细记录采样日期、样品编号、采样体积、气象条件等;采完样后将滤膜取下继续平衡24 h后称重(m2),m2-m1即为采集重量,PM2.5样品采集及洗脱具体参考文献[6]。

1.2.2 PM2.5染毒浓度设计与配制:实验前配制4 mg/ml的大气细颗粒物悬液为母液,根据参考文献及前期预实验的结果,大气细颗粒物染毒浓度设计为25、50、100、200、300、400 μg/ml浓度染毒,同时设置对照组。实验前将母液用1640完全培养液稀释到上述浓度。

1.2.3 MTT法测定HUVEC细胞增值情况:应用MTT法检测细胞活性,取对数期生长较好细胞,按照以5×104个/ml的密度,接种于96孔板进行培养,同时设置调零组、对照组、25、50、100、200、300、400 μg/ml染毒组,每组5个复孔;将染毒好细胞放入细胞培养箱进行培养6、12、18、24、36 h;培养时间结束,避光每孔加入配制好的浓度的5 mg/ml的 MTT 溶液20 μl,继续孵育4～6 h,每孔加入200 μl DMSO,在波长550 nm酶标仪中,检测每孔吸光度(OD值)。

1.2.4 MDA、LDH及ROS检测:将对数期生长较好细胞,按1×104个/孔,接种于96孔板上,培养细胞贴壁后染毒,设置调零组,对照组、25、50、100、200、300、400 μg/ml染毒组,每组5个复孔,染毒24 h吸取上清液,严格按照MDA、LDH、ROS试剂盒试剂盒操作步骤进行。

1.2.5 细胞凋亡率检测:取处在对数生长期细胞,以1×106个/ml密度,接种于6孔板,培养细胞贴壁后染毒,设置调零组,对照组、25、50、100、200、300 μg/ml染毒组,每组3个复孔,染毒24 h,染毒结束把细胞培养液吸出至离心管内,0.25%胰酶细胞消化液消化细胞,1 000 g离心5 min,弃上清,收集细并计数,加入5 μl Annexin V-FITC,混匀,再加入5 μl碘化丙啶,混匀,室温避光孵育10min,随即进行流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 PM2.5染毒对HUVEC存活率影响 染毒6、12、18、24、36 h随着染毒剂量升高,细胞存活率均逐渐降低,同一染毒浓度随着染毒时间延长,细胞存活率同样下降(P<0.05),且在染毒36 h,PM2.5浓度为400 μg/ml,细胞存活率仅为45.23%。见表1。

表1 PM2.5不同染毒剂量、不同染毒时间HUVEC细胞生长存活率 %,

2.2 PM2.5染毒对HUVEC MDA、LDH及ROS水平影响 PM2.5染毒HUVEC 24 h后,MDA、LDH、ROS水平,均随着染毒剂量增加而升高,且300、400 μg/ml达到最大值,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 PM2.5染毒对HUVEC MDA、LDH及ROS水平影响

2.3 PM2.5染毒对HUVEC细胞凋亡率的影响 经过PM2.5染毒后细胞早期凋亡率、中晚期凋亡率以及死亡细胞率均随着染毒浓度升高具有上升趋势,其中早期凋亡率变化最为明显,差异有统计学意义(P<0.05)(早期凋亡率随着浓度均迅速上升,中晚期凋亡率和死亡率变化缓慢)。见表3,图1。

图1 不同PM2.5浓度染毒细胞24 h后流失细胞图

表3 不同PM2.5浓度染毒细胞24h后细胞凋亡率变化

3 讨论

PM2.5污染是造成环境污染重要因素之一,有研究显示,>65岁的人群发现PM2.5每增加1.71 μg/m3,呼吸疾病以及心血管疾病的住院率分别增加3.47%、2.11%等[7],目前认为PM2.5致病机制主要为自由基过氧化机制、转录因子和炎性质因子激活等[8,9],认为PM2.5进入机体后可以诱发自由基可直接对DNA产生氧化损害,并且可以刺激机体产生大量的炎性因子等。

本文通过MTT实验显示在PM2.5染毒6、12、18、24、36 h随着染毒剂量升高,细胞存活率均逐渐降低,同一染毒浓度随着染毒时间延长,细胞存活率同样下降(P<0.05),且在染毒36 h,PM2.5浓度为400 μg/ml,细胞存活率仅为45.23%,这个不能满足实验要求,说明PM2.5对血管内皮细胞的增殖有明显的抑制作用,并呈现剂量-反应关系,这一结果可解释为PM2.5染毒导致细胞内发生氧化应激反应、DNA损伤等,从而降低细胞的增殖能力,说明PM2.5对HUVEC细胞具有明显的毒性效应。

ROS在氧化应激、动脉粥样硬化疾病中起着重要的作用[10]。不同浓度PM2.5染毒HUVEC 24 h后ROS水平随着染毒剂量增加而升高,说明PM2.5染毒可以诱导ROS形成,可能进而诱导细胞发生凋亡或者死亡等。MDA是人体膜脂过氧化最为重要的产物之一,MDA的产生可以加剧细胞膜的损伤,因此MDA在毒性细胞研究中最为常见的指标,可以通过MDA的表达水平了解脂质过氧化程度,进而测定膜受损程度等[11],本结果显示MDA表达水平随着PM2.5浓度的增加逐渐升高,并且在300、400 μg/ml升高更加明显,说明PM2.5染毒诱发了脂质过氧化反应,促进细胞凋亡,同样也有研究显高水平的MDA会引起蛋白质、核酸等生物大分子的聚合,具有明显细胞毒性,也有研究发现MDA影响线粒体呼吸链复合物及关键酶作用,同样反应脂质过氧化程度,间接反应机体受自由基的损伤程度等。LDH是一种糖酵解酶,可以催化乳酸生成丙酮酸,存在组织细胞胞质内,正常情况下不能透过细胞膜,如果细胞膜受到损伤或者破裂,LDH就会漏出,因此通过检测LDH漏出量间接反应细胞受损伤程度[12],本研究结果为HUVEC细胞LDH漏出量随着PM2.5浓度升高逐渐升高,存在明显剂量反应关系,说明PM2.5染毒后细胞膜通透性可能增加或者细胞张力降低,这是细胞趋向凋亡的过程,因此也反应可能在细胞凋亡中过程起着一定作用。

细胞凋亡是由细胞基因控制的程序化死亡,是细胞为了适应生存环境而自身调节死亡过程,外界因素通过各种途径诱发细胞凋亡调控异常就会引起疾病的发生[13]。大量文献研究显示毒物诱导细胞凋亡线粒体依赖途径起着主要作用,本文通过采流式细胞仪检测染毒后细胞凋亡率,结果显示随着PM2.5染毒剂量增加,细胞早期凋亡率、中晚期凋亡率以及死亡细胞率等均具有上升趋势,其中细胞早期凋亡率变化最为明显,说明细胞早期对于PM2.5毒性最为敏感,同时反应对细胞损伤程度,在PM2.5浓度为300 μg/ml细胞凋亡率大约在65.96%,说明高浓度的PM2.5可以诱发细胞大部分凋亡,细胞过度凋亡可能是某些疾病始发病因,比如动脉粥样硬化,因此认为PM2.5可能是诱发或者促进疾病发生的危险因素。

综上所述,PM2.5染毒对HUVEC细胞产生了明显的毒性作用,并且随着浓度升高毒性增强,对细胞损伤增大,并且可能促进细胞凋亡率升高。