金银花与牡丹皮的乙醇提取复配物对黄瓜枯萎病菌的抑制作用

吴文慧　田雨纯　牛吉祥　杨翼航　何瑞

摘    要：为探究金银花与牡丹皮对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cucumerinum）的抑菌效果，采用菌丝生长速率法测定金银花与牡丹皮的乙醇提取物对黄瓜枯萎病菌的抑菌作用。结果显示：单一金银花的乙醇提取物和金银花与牡丹皮的乙醇提取复配物均对黄瓜枯萎病菌有一定的抑菌作用，且随着药物浓度的增加，抑菌效果越显著。单一金银花的乙醇提取物浓度为25.0 mg·mL，作用72 h后对病原菌的抑菌活性最强，抑菌率为35.94%；金银花与牡丹皮的乙醇提取复配物浓度为25.0 mg·mL，作用72 h，复配比例为9∶1、7∶3时抑菌率均可以达到100%。综上可知，单一金银花的乙醇提取物及金银花与牡丹皮的乙醇提取复配物对黄瓜枯萎病菌均有抑制作用，但二者复配抑菌效果较好。

关键词：尖孢镰孢菌黄瓜专化型；黄瓜枯萎病；金银花；牡丹皮；乙醇提取复配物；抑制作用

中图分类号：S482.2+92         文献标识码：A          DOI 編码：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.09.009

Inhibitory Effect of the Ethanol Extract of Honeysuckle and Peony Bark on Fusarium Wilt of Cucumber

WU Wenhui， TIAN Yuchun， NIU Jixiang， YANG Yihang， HE Rui

（College of Food and Environment， Jinzhong University of Information Technology， Jinzhong， Shanxi 030805， China）

Abstract： In order to explore the antibacterial effect of honeysuckle and peony bark on Fusarium oxysporum f.sp.Cucumerinum， the mycelium growth rate method was used to determine the antibacterial effect of the ethanol extract of honeysuckle and peony bark on F. oxysporum f.sp.Cucumerinum. The results showed that the ethanol extract of single honeysuckle and the ethanol extract complex of honeysuckle and peony bark had certain antibacterial effect on F. oxysporum f.sp.Cucumerinum， and the antibacterial effect was more significant with the increase of concentration. The ethanol extract of single honeysuckle had the strongest antibacterial activity against pathogenic bacteria after 72 h at a concentration of 25.0 mg·mL^-1， and the bacteriostatic rate was 35.94%. The ethanol extract of honeysuckle and peony bark was compounded at a concentration of 25.0 mg·mL， 72 h of action， and the compounding ratio was 9∶1 and 7∶3. The bacteriostatic rate could reach 100%. In conclusion， the ethanol extract of single honeysuckle and the ethanol extract complex of honeysuckle and peony bark have inhibitory effects on cucumber Fusarium wilt， but the combination of the two has better bacteriostatic effect.

Key words： Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum; cucumber Fusarium wilt; honeysuckle; peony bark; ethanol extract complex; inhibition

黄瓜（Cucumis sativus L.）为葫芦科黄瓜属，一年生攀援或蔓生草本，以种子繁殖、直播或育苗移栽等方式进行繁殖。黄瓜在生长过程中会受到枯萎病的侵袭，该病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）引起的一种土壤传染病[1]。它从植物的根部侵入，是寄生在维管束内的系统性病害，其致病机理主要包括导管堵塞假说、毒素作用假说、信号传导系统、克服植物防御系统等。该病不仅严重影响黄瓜的产量，且其病原菌的毒素可严重危害动物及人类的健康[2-3]。

目前施加农药是控制枯萎病的主要方式，但农药的使用不仅会造成严重的“3R”问题，还可能危及人类的身体健康。近些年，生物防治以环境友好、安全高效、可持续性强的特征成为可替代化学防治的重要方式。金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥蓓蕾，其成分包括绿原酸、异绿原酸、黄酮化合物、芳樟醇、双花醇等[4]。有数据证实，金银花对部分植物特有的疾病（如炭疽病菌、灰霉病菌、枯萎病菌、早疫病菌）都有相应的抑制作用。牡丹皮为毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，主要包含酚及苷类、单萜及其苷类、三萜类、甾醇类、有机酸、黄酮类等成分，此外还含有大量的多糖及挥发油[5]，具有多种药理作用，如抗炎、抗肿瘤、控制新陈代谢、止痛等[6]。张新强等[7]发现，金银花对辣椒炭疽病原菌和番茄灰霉病原菌均有显著的抑菌作用。朱立成等[8]发现，牡丹皮丙酮提取物对番茄灰霉病菌、杨树溃疡病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌5种病原菌均有明显的抑制作用。以上研究表明，这2种中草药对多种植物病原真菌都有一定的抑制作用，因此可将其作为生物防治的植物材料。

本研究以应用中草药进行生物防治为切入点，开展金银花与牡丹皮的乙醇提取复配物对黄瓜枯萎病菌的抑菌試验，探究其最佳抑菌浓度及抑菌效果，为金银花与牡丹皮作为植物源农药提供理论依据，也为黄瓜枯萎病防治与新型植源性杀菌剂的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用金银花和牡丹皮均购自商洛千草行农副产品有限公司。黄瓜枯萎病菌（尖孢镰孢菌黄瓜专化型）由山西农业大学植物保护学院植物病理实验室提供。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂及耗材 95%乙醇、葡萄糖、琼脂粉、马铃薯、滤纸、纱布。

1.2.2 仪器设备 BSA224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、RE-52AA真空旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、RO.DI实验室超纯水机（上海和泰仪器有限公司）、SW-CJ-2F洁净工作台（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、100～1 000 μL移液枪（济南鑫贝西生物技术有限公司）、YXQ-70A立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、BGZ-146电热鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、CX31-32C02光学显微镜（奥林巴斯）、BGZ-250光照培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 中草药乙醇提取物的制备 将14 g金银花粉末与60%的乙醇溶液，14 g牡丹皮粉末与75%的乙醇溶液均按1∶15比例分别装入索氏提取器内，提取2 h，得到初步提取物质。将初提物置于旋转蒸发仪（温度60 ℃）内进行浓缩，并进一步于蒸发皿中用酒精灯加热，待出现黏稠膏状物后熄灭酒精灯，得到所需乙醇提取物。

1.3.2 菌种活化 将分离的尖孢镰孢菌黄瓜专化型菌株，接种置PDA培养基上培养，28 ℃，无光照。

1.3.3 药物配制 取金银花乙醇提取物，加水配制100 mg·mL、150 mg·mL、200 mg·mL、250 mg·mL的药液，装入试管保存。将金银花与牡丹皮乙醇提取物按照质量比9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9配制不同比例的乙醇提取复配物，然后分别加水配制100 mg·mL、150 mg·mL、200 mg·mL、250 mg·mL的金银花与牡丹皮乙醇提取复配物药液，装入试管保存。

1.3.4 加药培养基制备 用移液枪分别吸取1 mL不同浓度的药液，转移至灭菌的培养皿中，再向培养皿中加入9 mL融化的PDA培养基，得到浓度为10 mg·mL、15 mg·mL、20 mg·mL、25 mg·mL的加药PDA培养基，每组设置3次重复；对照组为1 mL无菌水加9 mL融化的PDA培养基。

1.3.5 黄瓜枯萎病菌菌丝生长测定 使用打孔器提取直径为5 mm且菌落生长良好的菌饼，放置在加药PDA培养基平板中央，以无菌水培养基作为对照，3个生物学重复。在28 ℃恒温培养箱中培育48、72 h时，用游标卡尺十字交叉法测量培养基中的菌落直径，按照菌落生长抑制率公式计算各处理组的生长抑制率。

生长抑制率=对照菌落直径－处理菌落直径/对照菌落直径×100%

1.3.6 黄瓜枯萎病菌菌丝形态观察 将牡丹皮与金银花复配比为1∶9、浓度为25.0 mg·mL的复配物处理组和对照组培养4 d后的菌丝分别做成切片，在光学显微镜40倍镜下观察菌丝形态。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel进行处理，以平均值加减标准差表示。采用SPSS进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 单一金银花及复配物对病原菌菌落生长的影响

由表1、图1可知，供试样品在处理48 h后，单一金银花和各种比例乙醇提取复配物对病原菌均表现出一定的抑菌效果，并随着药物浓度的增加，菌落直径逐渐减小，抑菌效果逐渐增加。单一金银花的乙醇提取物在浓度为10.0 mg·mL时，病原菌菌落直径为2.68 cm，抑菌效果最差；在浓度为25.0 mg·mL时，病原菌菌落直径为2.52 cm，抑菌效果最好。金银花与牡丹皮的乙醇提取复配物在复配比为1∶9时，菌落的直径在同浓度组中均为最大，整体的抑菌效果最差；在复配比为9∶1时，菌落的直径在同浓度组中均为最小，整体的抑菌效果最好，其他比例次之。复配比为9∶1时，浓度为15.0～25.0 mg·mL的抑菌效果最好，菌落直径均为0.50 cm。

由表1、图2可知，当供试样品在处理72 h后，金银花乙醇提取物和各种比例乙醇提取复配物表现出的抑菌效果与48 h处理后的抑菌效果基本一致。复配比为9∶1时，15.0～25.0 mg·mL浓度组的菌落直径仍保持0.50 cm，其余處理组的病原菌菌落直径均有不同程度的增加。这表明金银花与牡丹皮乙醇提取物的复配比为9∶1时对黄瓜枯萎病病原菌抑制效果最好。

2.2 单一金银花及复配物对病原菌的抑菌率

由表2可知，样品处理48 h后，单一金银花和复配物对黄瓜枯萎病菌的抑菌率最低为26.46%，最高可达到100%。单一金银花乙醇提取物在浓度为25.0  mg·mL时，抑菌率最高，为31.87%。金银花和牡丹皮乙醇提取物复配时，抑菌率大于单一金银花的抑菌率；在浓度为10.0 mg·mL时，各种配比复配物的抑菌率均为最小，随着浓度的增加抑菌率呈现增加的趋势，在浓度为25.0 mg·mL时，各种配比各种比例的抑菌率均达到最大值。其中，复配比9∶1时，浓度为15.0～25.0 mg·mL的抑菌率均为100%；复配比7∶3时，浓度为25.0 mg·mL的抑菌率也达到100%。从整体分析可以看出，不同配比处理对病原菌的抑菌率依次为：9∶1>7∶3>5∶5>3∶7>1∶9。

分析上述结果可知，不同浓度的单一金银花和乙醇提取复配物对黄瓜枯萎病菌均有抑制作用。当处于同一时间，同一浓度下，不同复配比的乙醇提取物抑制作用比单一金银花的乙醇提取物抑制作用更有效果，且不同复配比之间抑制作用差异也较为明显。在一定浓度范围内，随着乙醇提取物浓度的增加，抑制程度越高，抑菌效果越好，抑菌率也随之提高，且在特定的比例及浓度下抑菌效果可达到100%。

2.3 复配物对病原菌菌丝形态的影响

牡丹皮与金银花乙醇提取物复配比为1∶9，浓度为25.0 mg·mL的处理组和对照组在培养4 d之后，用显微镜40倍镜观察菌丝形态（图3），可见处理组中的菌丝生长异常，出现膨胀畸变，断裂等现象（图3-G）；对照组的菌丝生长正常，菌丝体细长且分枝较多，整体呈现光滑状态（图3-H）。观察结果说明，处理组药物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用较为明显。

3 讨论与结论

本研究结果表明，单一金银花及乙醇提取复配物对黄瓜枯萎病菌的菌丝均有不同程度的抑制作用，主要体现为造成不利环境抑制菌丝生长。其中，单一金银花乙醇提取物在浓度为25.0 mg·mL时，抑菌效果最好；金银花与牡丹皮乙醇提取物复配比9∶1时，浓度为15.0～25.0 mg·mL时抑菌效果最好，抑菌率可达到100%。复配物处理后的菌丝体在显微镜下观察，可以明显地看到病原菌菌丝出现膨胀断裂等畸变。

3.1 金银花对病原菌的抑制作用

本研究发现金银花的乙醇提取物对黄瓜枯萎病菌有一定的抑制作用，但不同浓度的提取物抑菌效果不同。孙全友等[9]认为，金银花抗菌可能是改善了有益菌而对致病菌起作用，也可能与破坏细菌细胞壁完整性有关。王乾芬等[10]研究发现，金银花枝叶发酵产物呈现出抑菌效果，且比未发酵提取液的抗氧化能力更强。

3.2 牡丹皮对病原菌的抑制作用

有研究报道牡丹皮乙醇提取物对病原菌同样有抑制作用。胡永志等[11]发现牡丹皮提取物对牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌具有一定的抑菌活性。魏慧等[12]研究牡丹皮乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果显示抑菌率达到了82.1%。

3.3 金银花与牡丹皮复配物对病原菌的抑制作用

研究表明，单一金银花乙醇提取物对黄瓜枯萎病菌的生长有一定的抑制作用，且与牡丹皮乙醇提取物复配时，不仅表现出优于单剂的抑菌效果，还可以将黄瓜枯萎病菌完全杀死，极大地促进了复配杀菌剂的快速发展[13-14]。黄南[15]通过微生物有机肥对黄瓜枯萎病的影响，表明生防菌解淀粉芽孢杆菌SQR9和有机肥经过二次发酵形成的微生物有机肥（BIO），能有效抑制土壤中尖孢镰孢菌黄瓜专化型的数量。Abdelkhalek等[16]研究证实，Bacillus velezensis PEA1有较强抗尖孢镰刀菌的功效。Ahlem Nefzi等[17]通过高效的醇提取法获得苦参提取物，并验证得出其对镰孢菌具有抑制作用。

近些年，许多人为了达到除虫杀菌的目的而滥用各种化学杀菌剂，使植物病原菌的抗药性增强，并且造成了环境污染，绿色环保、安全高效的植物源杀菌剂的开发逐渐成为植物保护领域研究的重点。金银花与牡丹皮是我国传统中药材，含有种类较为丰富的次生代谢物质，如酚类、黄酮类、萜类、皂苷、有机酸等[18-20]，具有较好的农药活性，其中酚类在植物对病原菌的非宿主抗性中发挥重要作用。由药用植物制成的植物源杀菌剂相对于化学杀菌剂更加绿色环保，利用药用植物开发天然的绿色杀菌剂也是现代绿色农业的发展方向[21]。

目前，中草药提取物用于植物病菌抑制研究报道还较少，应该进一步加强这方面的研究。本研究中发现的2种中草药乙醇提取物的作用方式、作用机理以及在活体上的抑菌效果还有待于进一步研究。

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