视网膜母细胞瘤化疗耐药的研究进展

俞依琳,葛盛芳,范佳燕

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤,化疗是目前治疗RB最常用的方法,包括静脉化疗、动脉化疗和玻璃体腔化疗。然而,RB的化疗耐药时有发生,是导致RB患者保眼治疗失败的主要原因。因此,探索RB化疗耐药的发生发展机制、寻找RB治疗新策略及药物联合治疗的新方法具有重要临床意义。本文综述了RB细胞可通过ATP结合盒式蛋白(ABC转运蛋白)、非编码RNA、表观遗传学修饰、自噬、上皮-间充质转化、细胞外基质改变等多种途径获得化疗耐药性,并对其潜在的治疗靶点或药物进行总结,以期为RB化疗耐药性的进一步研究提供参考。

references for further research on chemotherapy resistance of RB.

•KEYWORDS：retinoblastoma; chemotherapy resistance; cancer therapy

0 引言

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤,约95%的病例发生在5岁之前,是儿童期致盲、致残的主要眼部疾病[1-2]。RB的全球发病率约为1/18000～1/16000,相当于每年约有8 000例新发病例[2-3]。既往研究认为,RB起源于原始视网膜祖细胞或视锥前体细胞[4],通常由视网膜母细胞瘤基因(RB1)的双等位突变引起,可分为遗传型(约占40%)和非遗传型(约占60%)。RB的主要临床表现有白瞳症、斜视、眼球突出、青光眼、前房积脓等,晚期可侵犯视神经,甚至发生颅脑和全身远处转移,危及生命。根据RB的国际分期(IIRC分期及TNM分期),同时考虑患者的基础健康情况、累及眼数、年龄、肿瘤的大小和位置以及转移扩散的可能性等方面,RB的治疗方式可选择动/静脉化疗、局灶治疗、放疗和/或眼球摘除术[5]。

化疗是RB最主要的治疗方法,包括全身静脉化疗、动脉化疗和玻璃体腔注射化疗。静脉化疗(IVC)是最传统的化疗方式,常用的方案为长春新碱(vincristin,VCR)、依托泊苷(etoposide,VP-16)和卡铂(carboplatin,Carbo)联合的VEC方案[6]。选择性动脉化疗(IAC)通过股动脉-颈内动脉-眼动脉将化疗药物直接灌注至眼内进行治疗,常用的化疗药物主要为马法兰(melphalan)、卡铂和拓扑替康[7]。相比IVC,IAC的眼内局部药物浓度更高、对肿瘤的杀伤作用更强、且全身副作用小,显著提高了RB患儿的保眼率[8]。另外,RB常伴有玻璃体腔肿瘤种植或播散,玻璃体腔注射化疗作为保眼治疗的辅助手段之一,对于处理视网膜下种植和视网膜瘤体复发有较好的治疗效果[9]。目前,玻璃体腔注射化疗的常用药物主要包括卡铂、马法兰、甲氨蝶呤等。

近十几年来,RB的治疗模式取得了重大进展,从单纯IAC发展为IAC、IVC、玻璃体腔注射化疗等多种化疗方式[5],显著提高了RB保眼治疗的成功率。然而,随着化疗次数的不断增加,RB对化疗药物的敏感性逐渐降低,进一步产生化疗耐药性,最终导致保眼治疗的失败。如RB一线化疗药物卡铂通过干扰DNA修复[6,10]诱导细胞凋亡,长期接受卡铂治疗的患者可通过多重机制[11-12]获得耐药性,造成保眼治疗失败。研究发现,RB的组织病理学特征与其耐药性密切相关[13],Schouten-Van Meeteren等[13]发现,未分化的RB细胞对卡铂、多柔比星和异环磷酰胺更加敏感。然而,目前对于RB发生化疗耐药的机制仍不完全清楚。因此,解析RB药物敏感性的调控机制,探索其关键靶点,对RB的保眼治疗具有重要的临床意义。

1 视网膜母细胞瘤耐药发生机制

1.1 ABC转运蛋白介导在肿瘤治疗的过程中,获得性多药耐药(MDR)时常发生,是造成肿瘤生长和转移的主要原因之一,导致患者的总生存期短、预后差。目前研究认为,ATP结合盒式蛋白(ABC转运蛋白)过表达诱导的药物外排是发生MDR的最主要原因之一[14]。ABC转运蛋白是一个庞大且普遍存在的转运体超家族,从ABC-A到ABC-G可分为7个亚家族,其中与癌症MDR相关的主要包括ABC-B中的ABCB1/P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、ABC-G中的ABCG2/乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和ABC-C中的ABCCs/多药耐药相关蛋白(MRPs)[15]。既往研究发现,ABC转运蛋白与RB化疗耐药性的产生密切相关。在RB中,MRPs和p170蛋白的表达增加与其化疗失败相关,使用环孢素可抑制p170表达而改善化疗效果[16]。在具有依托泊苷/卡铂耐药性的RB细胞系和组织中均检测出ABCB1和ABCC3蛋白的表达升高[17]。Chan等[18]在多种耐药的RB细胞系中检测出P-gp的表达较化疗敏感组显著增加,表明RB中的P-gp水平可能是监测药物疗效的潜在靶点。另外,Zhang等[19]通过单细胞RNA测序,发现卡铂诱导的RB耐药性与ABC转运蛋白的转录组重编程相关;使用ABCB1抑制剂可提高RB对卡铂的治疗敏感性。FOXM1(Forkhead Box M1)是控制细胞增殖的关键基因之一,研究发现,FOXM1可通过直接上调ABC转运蛋白C79(ABCC4)的转录增强卡铂耐药细胞(Y-4CR)的耐药性[11]。

1.2非编码RNA调控非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一种特殊类型的RNA,尽管ncRNA缺乏翻译成蛋白质的能力,但其对细胞的增殖、凋亡、代谢等多种生物过程具有重要的调控作用[20]。ncRNA通常包括长链非编码RNA(lncRNA)、microRNA(miRNA)和环状RNA(circRNA),这些ncRNA也被证实与各种眼部疾病(如白内障、早发性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、眼肿瘤等)的发生和进展相关[21]。既往研究发现,在RB化疗耐药的发展进程中,ncRNA也发挥着重要作用。近期研究发现,miR-34a可通过调控MAGE-A/p53轴和Notch1的表达增强RB对化疗的敏感性[22-23]。miR-222介导的VHL下调通过增加缺氧诱导因子1α(HIF1α)的表达促进RB化学耐药性的产生[24]。lncRNA-LINC00152通过招募miR-1调节RB中的YAP613,增强其对卡铂和阿霉素的耐药性[25]。Wang等[26]发现,lncRNA UCA1作为miR-206的内源性RNA与其他RNA竞争,上调c-MET和AXL表达,诱导RB产生卡铂耐药性。另外,He等[27]发现,miR-184在化疗抵抗的RB细胞系中下降最显著,直接抑制SLC7A5表达,增强RB对化疗药物的敏感性。上述研究提示,调节细胞内ncRNA的表达可作为改善RB治疗中化学耐药性的潜在治疗靶点。

1.3表观遗传学修饰表观遗传学修饰是指在不改变DNA序列的情况下,受环境或其他因素影响导致其基因表达发生可遗传的改变,主要包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、RNA修饰等。越来越多的证据表明,异常的表观遗传调控有助于肿瘤抗性的产生。因此,靶向表观遗传调节因子是逆转耐药性的有效策略[28]。

泛素样含PHD和环指域1(ubiquitin-like ring finger domains,UHRF1)是DNA甲基化和组蛋白修饰的重要表观遗传调控因子,也是癌细胞增殖和存活的关键调控因子,近年来在癌症研究中颇受关注。He等[29]发现,UHRF1也是调节RB药物敏感性的关键因子,具体来说,下调UHRF1通过介导XRCC4的低表达增强细胞DNA损伤和凋亡,从而使RB细胞对依托泊苷和喜树碱的敏感性增加。

DOT1L(DOT1 like histone lysine methyltransferase)是一种组蛋白H3K79甲基转移酶,在激活和维持基因转录过程中起着重要作用[30]。最近,DOT1L已成为MLL基因重排型血液肿瘤的一个热点治疗靶点[31]。Mao等[32]发现,在RB中,DOT1L通过靶向HMGA2或直接破坏DNA损伤修复反应,加速细胞凋亡,从而增强RB细胞对化疗药物的敏感性[32]。

烟酰胺N-甲基转移酶(NRMT)是一种甲基化酶,在体内能使烟酰胺(NAM)甲基化,生成N1-甲基烟酰胺(MNAM),参与多种代谢途径。研究表明,NRMT通过调控SAM/SAH比值,降低组蛋白的整体甲基化水平,改变细胞的表观遗传状态[33],从而促进肿瘤进展。Li等[34]在顺铂耐药的RB细胞系中发现NRMT的表达显著升高,下调NRMT可通过调控CENPA/Myc/Bcl2信号轴提高RB细胞对顺铂的敏感性。

1.4自噬自噬(autophagy)是细胞的一种防御机制,通过溶酶体介导,消除受损的细胞器和蛋白质聚集物,促进细胞生存。自噬在肿瘤起始和发展的所有阶段均有参与,在癌症中起双重作用,显示出肿瘤抑制或致癌活性。最近研究显示,自噬的激活与肿瘤细胞的耐药性相关,可作为抵抗化疗耐药的潜在治疗靶点[35-36]。在RB中,研究发现卡铂耐药的细胞具有更高的自噬活性,进而驱动RB对多种化疗药物(如依托泊苷和长春新碱)耐药性的产生[37]。另外,CD24是一种高度糖基化的蛋白,通过锚定糖基磷脂酰肌醇与膜脂筏域相连,在多种肿瘤中与患者的不良预后相关[38],且与肿瘤化疗耐药的产生密切相关[39-40]。Sun等[41]发现,在人RB组织及细胞系中,CD24的表达上调与其对长春新碱的耐药性相关。具体来说,CD24可募集PTEN,通过调节PTEN/AKT/mTORC1途径激活自噬,从而降低RB对长春新碱的敏感性[41]。然而,不受限制的自噬激活也可导致细胞死亡,称为自噬依赖的细胞死亡。基于此,诱导自噬依赖的细胞死亡正在成为一些实体肿瘤的潜在治疗策略[42-43]。Liu等[37]报道了一种通过诱导自噬依赖性的铁死亡消除RB多重耐药性的新策略,该研究使用4-辛基衣康酸(4-octyl itaconate)诱导自噬依赖性铁死亡,从而清除多药耐药的RB细胞[37]。

1.5上皮-间充质转化上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指上皮细胞获得间充质表型的细胞重编程过程,参与肿瘤侵袭、转移瘤的形成和肿瘤治疗耐药性的产生[44]。EMT通过下调E-钙黏蛋白和紧密连接黏附分子导致上皮表型丢失,使癌细胞转变为具有侵袭特征的间充质表型,从而促进化疗耐药性的产生[44]。研究发现,长期曝露于化疗药物的RB细胞可通过ZEB1/SNAI2介导的EMT获得转移样表型,并且通过ABCB1(MDR1)和组织蛋白酶L(CTSL)介导的药物外排进一步获得化疗耐药性[45]。Suresh Babu等[45]通过miRNA微阵列检测发现,miR-181a-5p在晚期RB中表达显著降低,这与EMT及耐药相关基因的改变相关;提高miR-181a-5p水平,可降低ZEB1和SNAI2水平,暂停EMT进程,从而提高RB对化疗药物的敏感性。

1.6细胞外基质改变细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是由细胞合成、分泌的生物大分子在细胞表面或细胞之间构成的复杂网络结构。细胞外基质表达谱的改变在肿瘤的发生发展中有着重要作用。研究显示,在依托泊苷耐药的RB中,ECM的表达谱发生显著改变,如蛋白聚糖mRNA表达水平显著降低;α1-层黏连蛋白、纤连蛋白以及胶原蛋白Ⅳ表达水平显著降低[46]。

1.7其他机制

肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSCs)是肿瘤中的一小群具有无限增殖潜能的、能重建肿瘤的细胞[47]。最近研究表明,CSCs诱导的癌细胞干样表型是癌症复发、耐药和转移的主要因素[48]。研究发现,在RB肿瘤干细胞中,过表达miR-3163可降低 ABCG2的表达,显著改善RB对顺铂、卡铂、长春新碱、多柔比星和依托泊苷的多药耐药性[49]。

细胞焦亡又称细胞炎性坏死,是一种有别于细胞凋亡的溶解性和炎症性程序性细胞死亡途径[50]。目前认为,细胞焦亡是由细胞内部一类叫做Gasdermins(GSDMs)的蛋白家族所介导的程序性坏死。GSDMs家族共有6个成员,其中5个成员(GSDM-A/B/C/D/E)均可以导致细胞焦亡,但其激活机制各不相同。最新研究发现,GSDM-E通过触发细胞焦亡抑制多种肿瘤的进展,包括三阴性乳腺癌、结直肠肿瘤和黑色素瘤[51]。Li等[52]发现,GSDM-E在RB组织和细胞系中的表达均显著降低,上调 GSDM-E可通过增强细胞焦亡提高RB细胞对卡铂的敏感性。

综合应激反应(ISR)可促进细胞对来自肿瘤微环境压力的适应[53]。其中,激活转录因子4(ATF4)是线粒体应激调控中的关键基因,属于广泛应激(如缺氧或营养不足)反应的一部分,其作为数百个基因活动的总开关,帮助细胞在各种压力下生存。最近研究表明,许多类型的肿瘤进展依赖于ATF4相关的应激反应,通过参与抗氧化反应、自噬、氨基酸生物合成和转运等多种途径促进肿瘤进展[54-59]。另外,ATF4也与肿瘤化疗耐药性的产生相关,Gao等[60]发现,YAP/TAZ和ATF4通过抑制铁死亡使HCC细胞获得Sorafenib耐药性。在RB中,研究发现,低剂量给予核糖体蛋白L41(RPL41)肽[61]可通过降解ATF4显著提高RB细胞对卡铂的敏感性[62]。

2 小结与展望

化疗耐药主要可分为单药耐药和多药耐药。在RB耐药性的发展过程中,一般是以单药耐药起始,之后逐步进展成为多药耐药。根据既往的研究结论,RB细胞化疗耐药性的发生发展主要由ABC转运蛋白过表达[63]、ncRNA调控、表观遗传学修饰、自噬、EMT、ECM改变等多种途径介导(表1)。针对上述机制,使用相应的靶向药物可提高RB化疗的疗效。然而,目前关于RB耐药性机制的研究尚少,主要集中在对RB细胞系层面的体外实验研究,较少涉及体内研究;同时,目前已发表的相关研究也大多集中在ncRNA调控方面,未找到与耐药性相关的特异分子机制。因此,未来对于RB产生化疗耐药的机制仍需进一步探索,寻找RB化疗耐药性发展的潜在治疗靶点。

表1 提高RB药物敏感性的潜在治疗靶点或药物

我国晚期RB患者居多,化疗是最主要的治疗方法,根据不同给药途径分为IVC、IAC和玻璃体腔注射化疗。RB化疗的多数药物都是传统的DNA毒性或细胞毒性药物,尽管这些传统药物在RB的早期治疗以及保眼治疗方面表现出一定的有效性,但药物的耐药也时有发生,造成化疗疗效显著下降,成为保眼治疗失败的主要原因。另外,RB瘤体异质性强,目前主要的突变基因都是不可成药靶点,导致RB靶向治疗研究领域一直面临着严峻挑战。因此,探索RB化疗耐药的发生发展机制、寻找RB治疗新策略及寻找药物联合治疗的新方法具有重要临床意义。