FasL抑制剂对大鼠角膜移植术后角膜细胞凋亡及Treg的影响

曹 倩,李 兰,李 勇,李云川,邹 莹,龙俊君,何柳余,刘浩文

目的:探索大鼠角膜移植术后玻璃体腔内注射FasL抑制剂对角膜细胞凋亡,角膜Fas、FasL表达,全血和颈部淋巴结中Treg数量及排斥反应指数的影响。

方法:将24只SD大鼠24眼行穿透性角膜移植术,术后随机分为玻璃体腔内注射PBS组(12只12眼)、FasL抑制剂组(12只12眼),每周记录角膜排斥反应指数,术后1、3、5wk取全血、颈部淋巴结检测Treg数量,取角膜组织测Fas、FasL表达及凋亡细胞数量。

结果:FasL抑制剂组角膜Fas、FasL表达较PBS组明显下降(均P<0.05);FasL抑制剂组角膜细胞凋亡较PBS组明显减少,FasL抑制剂组术后5wk凋亡最少;术后3wk开始FasL抑制剂组Treg数量较PBS组明显升高(均P<0.05),FasL 抑制剂组角膜移植排斥反应评分明显低于PBS组(均P<0.05)。

结论:大鼠角膜移植术后玻璃体腔内注射FasL抑制剂可减少角膜各层细胞凋亡,增加全血、颈部淋巴结中Treg的数量,减轻排斥反应。

•KEYWORDS：FasL inhibitor; corneal transplantation; rejection; Treg

0 引言

角膜移植术是终末期角膜疾病患者复明的唯一方式,但每年手术不足万例,相对于亟待手术的400万角膜盲患者来说是杯水车薪。目前我国角膜植片的主要来源是心脏死亡供体捐献(donation after cardiac death,DCD)的角膜。在供体角膜植片极度缺乏的情况下对于角膜新生血管、角膜穿孔等高危角膜移植术排斥反应率高达50%[1],最终患者视力纠正不佳甚至再次失明。因此探索角膜移植排斥反应的发生机制尤为迫切。排斥反应是多因素参与的复杂免疫反应,其发生机制目前仍不十分清楚。既往认为主要是T细胞介导的迟发型超敏反应,细胞凋亡不会引起排斥反应,但近年来研究表明[2-4]在同种异体器官移植中,细胞凋亡与移植后的急、慢性排斥反应有密切的联系。Fas信号途径与FasL结合后,表达Fas的细胞被诱导发生凋亡。角膜移植术后Fas和FasL可见在上皮细胞层、基质层、内皮细胞层表达,且Fas和FasL表达程度与排斥反应程度呈正相关[5]。近期的研究表明Treg细胞在角膜移植免疫排斥反应中扮演重要角色[6],通过增加小鼠体内的Treg细胞数量可降低排斥反应率[7]。为了解Fas途径介导角膜细胞凋亡后Treg细胞的变化情况,本研究建立心脏死亡供体大鼠角膜移植模型后,将FasL抑制剂注射到玻璃体腔内,观察角膜植片细胞凋亡情况及排斥反应,并检测大鼠全血、颈部淋巴结中Treg数量。旨在为角膜移植排斥反应的防治提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1材料选取体质量为220～250g的雄性8～10周龄SD大鼠,动物由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,江苏美迪森生物医药有限公司有限公司供应饲料,饲养环境为清洁级,适应性饲养1wk后进行实验。本实验经昆明市第一人民医院医学伦理委员会动物实验伦理审批(No.YLS2020-119),符合动物伦理。

试剂:PE/Cyanine7 anti-rat CD4 Antibody(Biolegend公司),PE anti-mouse/rat/human FOXP3 Antibody(Biolegend公司),FITC anti-rat CD25 Antibody(Biolegend公司),FasL抑制剂(Selleck公司),TUNEL试剂盒(Roche公司),Fas抗体(Abcam公司),FasL抗体Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1角膜移植模型建立12只SD大鼠建立心脏死亡模型[8]后取双侧眼角膜作为供体植片,24只SD大鼠作为受体,选取右眼作为手术眼。采用硬币法随机分为两组:PBS组(12只12眼):术毕玻璃体腔内注射PBS注射液1IU;FasL抑制剂组(12只12眼):术毕玻璃体腔内注射FasL抑制剂1IU(10μg)。术毕结膜囊内点妥布霉素眼膏,6-0缝线缝合眼睑中部,术后24h剪开眼睑缝线,点妥布霉素眼膏,每天1次,连续使用1wk。

1.2.2角膜移植术后排斥反应评分术后用体视镜每天观察术眼角膜混浊、水肿、新生血管情况,由同一医生根据表1进行排斥反应评分,三项评分之和为排斥反应指数(rejection index, RI),当RI≥6,确定为排斥[9]。

表1 角膜移植术后排斥反应评分标准

1.2.3流式细胞术分别于术后1、3、5wk处死每组大鼠各4只,取心脏全血、颈部淋巴结,提取出单个细胞后用流式细胞术检测Treg数量。

1.2.4 TUNEL染色取角膜组织用TUNEL染色检测角膜细胞凋亡数量:每张切片任意取5个高倍视野同时对每个视野阳性细胞数进行计数。凋亡指数=阳性细胞数/有核细胞总数×100%。

1.2.5免疫荧光染色石蜡包埋角膜组织切片后用免疫荧光染色法测Fas/FasL表达情况:Fas(绿色染色为阳性染色)、FasL(红色染色为阳性染色)。阳性结果使用Image pro plus软件,每张图片取5个高倍视野进行统计。阳性表达率=阳性区域面积/总面积×100%。

2 结果

2.1术后不同时间角膜Fas和FasL含量比较PBS组术后不同时间角膜Fas含量比较差异有统计学意义(F=47.52,P=0.0016),术后3、5wk与术后1wk比较差异均有统计学意义(P<0.05)。FasL抑制剂组术后不同时间角膜Fas含量比较差异无统计学意义(F=2.581,P=0.1906)。PBS组术后不同时间角膜FasL含量结果比较差异无统计学意义(F=3.79,P=0.1193)。FasL抑制剂组术后不同时间角膜FasL含量结果比较差异无统计学意义(F=1.036,P=0.434)。术后1、3、5wk两组间Fas和FasL含量比较差异均有统计学意义(P<0.05),见图1,表2、3。

图1 术后不同时间免疫荧光染色法检测Fas和FasL表达情况 蓝色:DAPI细胞核染色;绿色:Fas阳性表达;红色:FasL阳性表达。

表2 术后不同时间角膜Fas含量比较

表3 术后不同时间角膜FasL含量比较

2.2术后不同时间角膜凋亡指数比较PBS组术后不同时间角膜凋亡指数比较差异有统计学意义(F=8.167,P=0.0387),术后5wk与术后1wk比较差异有统计学意义(P<0.05)。FasL抑制剂组术后不同时间角膜凋亡指数比较差异有统计学意义(F=49.53,P=0.0015),术后3、5wk与术后1wk比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后1、3、5wk两组间角膜凋亡指数比较差异均有统计学意义(P<0.05),见图2,表4。

图2 术后不同时间TUNEL染色检测角膜细胞凋亡情况 棕黄色染色为凋亡染色阳性细胞。

表4 术后不同时间角膜凋亡指数比较

2.3术后不同时间全血和颈部淋巴结Treg数量比较PBS组术后不同时间全血Treg数量比较差异有统计学意义(F=77.52,P=0.0006),术后3、5wk与术后1wk比较差异均有统计学意义(P<0.05);术后5wk与术后3wk比较差异有统计学意义(P<0.05)。FasL抑制剂组术后不同时间全血Treg数量比较差异有统计学意义(F=34.96,P=0.0029),术后3、5wk与术后1wk比较差异有统计学意义(P<0.05);术后5wk与术后3wk比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后1wk,两组间全血Treg数量比较差异无统计学意义(P>0.05);术后3、5wk,两组间全血Treg数量比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表5,图3A。

图3 术后不同时间流式细胞术检测Treg比例 A:全血Treg检测结果;B:颈部淋巴结Treg检测结果。

表5 术后不同时间全血Treg数量比较

PBS组术后不同时间颈部淋巴结Treg数量比较差异有统计学意义(F=18.44,P=0.0096),术后5wk与术后1、3wk比较差异均有统计学意义(P<0.05)。FasL抑制剂组术后不同时间颈部淋巴结Treg数量比较差异有统计学意义(F=790.1,P<0.0001),术后3、5wk与术后1wk比较差异均有统计学意义(P<0.05);术后1wk,两组间颈部淋巴结Treg数量比较差异无统计学意义(P>0.05);术后3、5wk,两组间颈部淋巴结Treg数量比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表6,图3B。

表6 术后不同时间颈部淋巴结Treg数量比较

2.4术后不同时间角膜植片排斥反应评分比较PBS组术后不同时间角膜植片排斥反应评分比较差异有统计学意义(F=10.44,P=0.0036),术后3、5wk与术后1wk比较差异均有统计学意义(P<0.05)。FasL抑制剂组角膜植片排斥反应评分比较差异有统计学意义(F=4.488,P=0.0406),术后5wk与术后1wk比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后1wk,两组间角膜植片排斥反应评分比较差异无统计学意义(P>0.05),术后3、5wk,两组间角膜植片排斥反应评分比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表7,图4。

图4 体视显微镜观察两组术后不同时间移植角膜植片图。

表7 术后不同时间角膜植片排斥反应评分比较 分)

3讨论

角膜移植术后排斥反应的有效防治是临床工作中关注的重点和难点,然而角膜移植术后排斥反应是多因素共同作用的复杂机制,至今仍未完全明了。近年来的研究表明细胞凋亡与移植术后的排斥反应有密切关系。角膜移植术后内眼微环境改变,眼前段免疫赦免机制受到破坏,大量炎性细胞存在于角膜植片及房水中。角膜基质细胞受刺激后分泌FasL,形成上皮-基质,基质-基质的旁分泌和自分泌Fas/FasL体系,介导和调控基质细胞凋亡。上皮和内皮细胞通过分泌FasL,既可以通过自分泌方式作用于自身,也可以通过旁分泌作用于基质细胞,介导细胞的凋亡。FasL抑制剂是否会减少角膜植片基质细胞的凋亡?Fas细胞凋亡抑制分子已被确定为Fas信号传递的负调控因子,随后被发现在许多生理过程中发挥多方面的作用[10]。

既往研究表明在小鼠前房内注射Fas受体的小肽抑制剂ONL1204通过抑制Fas信号通路,在诱导型青光眼小鼠模型中提供强大的神经保护,可以减少视网膜神经节细胞的凋亡,防止青光眼发病机制中多种炎症通路的诱导[11]。Zacks等[12]发现阻断Fas受体的激活,可以防止在面对急性氧化应激时的视网膜色素上皮损伤,除了减少与年龄相关性黄斑病变过程相关的炎症反应外,还能直接抑制细胞死亡,表明FasL抑制剂无视网膜毒性。本研究使用心脏死亡供体同种类SD大鼠供体进行角膜移植模型构建,在术后14d均出现排斥反应[8]。大鼠前房极浅,角膜移植术毕需要前房内注射空气形成前房,反复进行前房的注射操作容易造成药物渗漏,并发性白内障、角膜内皮损伤等,因此我们参照Zacks等[12]方法用FasL抑制剂进行玻璃体腔注射,探讨FasL抑制剂在减轻角膜移植排斥反应中的作用机制。

近年来,发现角膜的免疫赦免地位与Fas/FasL系统密切相关[13],Fas、FasL是人体细胞表面的一种膜蛋白,二者结合后可在短短数小时内诱发细胞凋亡。Fas属于肿瘤坏死因子—神经生长因子受体家族Ⅰ型膜蛋白,是由325个氨基酸组成的分子量为45kD的细胞膜表面受体蛋白。FasL是分子量约为40kD的Ⅱ型膜蛋白,细胞外区约有150个氨基酸与TNF家族成员同源。许多组织及细胞均有一定的Fas表达,研究证实在活化的成熟淋巴细胞中Fas表达增高,FasL表达局限,常见于活化的T淋巴细胞,也在部分睾丸和眼组织表达。

急性排斥反应发生时,角膜植片边缘及中央与正常角膜相比Fas和FasL蛋白表达均呈现上升趋势,表达于上皮层及浅基质层,距植片边缘0.5mm内均较中央区域表达高[14]。既往研究结果提示Fas系统与凋亡在排斥反应过程中扮演了重要角色一致,推测可能是外来抗原激活了体内的免疫因子或细胞,它们可诱发局部角膜组织Fas及FasL的异常表达,进而使Fas系统途径介导的细胞凋亡的异常发生,造成组织损害,将引发或促进移植排斥反应的发生发展[12]。

本实验中角膜移植术毕玻璃体腔注射FasL抑制剂后分别于术后1、3、5wk检测角膜组织Fas、FasL的表达,与PBS组相比均有不同程度下降。FasL抑制剂组角膜组织的Fas、FasL含量术后1、3、5wk差异不明显,表明FasL抑制剂对降低角膜组织中Fas、FasL的含量的作用稳定。检测角膜凋亡细胞数量,FasL抑制剂组较PBS组明显下降。术后3wk开始效果明显,持续至术后5wk,且FasL抑制剂组从术后3wk开始排斥反应评分低于PBS组。提示玻璃体腔注射FasL抑制剂可减少角膜全层细胞的凋亡,减少排斥反应评分。

当眼部组织发生感染、过敏、自身免疫病等炎症反应时Treg细胞也迁移至病灶部位,发挥抗炎作用,抑制病程进展[15-18]。有研究检测小鼠行同种异体角膜移植术后免疫耐受与发生排斥的小鼠植片和局部引流淋巴结内Treg细胞的数量及功能,证实了Foxp3+Treg细胞参与了眼局部角膜移植术后免疫耐受[17]。

本实验中检测到FasL抑制剂组、PBS组在术后1wk全血Treg数量差异不显著,术后3wk开始FasL抑制剂组较PBS组明显升高,术后3、5wk FasL抑制剂组颈部淋巴结中Treg数量较PBS组明显升高,排斥反应评分较PBS组低,且术后5wk排斥反应评分与术后3wk相比无统计学差异,表明玻璃体腔注射FasL抑制剂于术后3wk开始出现明显抗排斥作用,且一直维持至术后5wk。可能与角膜移植术后Treg经引流淋巴结迁移至炎症部位发挥作用有关。文献显示当Fas与FasL以三聚体形式结合时,可激活细胞内Fas死亡信号系列的活性,诱导表达Fas的细胞发生凋亡[15],角膜移植术后玻璃体腔注射的FasL抑制剂为分子量460.34kD的小分子化合物,可通过血房水屏障进入血液系统,抑制了Treg表面Fas与FasL的结合,从而减少Treg细胞凋亡。抑制Fas系统分子的过度表达,可能是排斥反应防治的有效途径。近年不少研究者提出通过调控Treg细胞来诱导免疫耐受的免疫治疗具有良好的运用前景[19],主要为增加体内Treg数量,诱导Treg细胞迁移至病灶来降低排斥[7]。CD4+CD25+Treg仅占外周血及脾脏CD4+T细胞的5%～10%,数量较少,本研究从减少角膜移植术后Treg细胞凋亡方面着手,为角膜移植排斥反应的治防治提供了新思路。

本实验结果提示大鼠角膜移植术后玻璃体腔注射FasL抑制剂3wk后可减少大鼠移植角膜细胞的凋亡,提高Treg细胞含量,提高移植物免疫耐受,减少排斥反应。但到目前为止,还没有鉴定出与Fas细胞凋亡抑制分子相互作用的蛋白,这使得我们很难确定其结构和准确理解其功能的分子机制[10]。因此,未来迫切需要识别Fas细胞凋亡抑制分子在不同生理和病理背景下的相互作用蛋白。FasL抑制剂玻璃体腔注射引起全血和颈部淋巴结Treg升高的具体机制还有待进一步研究。