EW-7197对TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及机制

温佳敏,郑 磊,艾伟鹏

目的:探讨ALK5抑制剂EW-7197对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖和迁移的影响及其机制。

方法:采用MTS法检测细胞增殖率,并摸索EW-7197最佳的作用浓度和作用时间。之后将细胞分为3个组,分别为正常对照组、TGF-β1诱导组和TGF-β1+EW-7197处理组,采用Transwell小室观察各组细胞迁移情况,采用Western blot检测各组细胞Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平。

结果:MTS结果显示,不同处理条件的EW-7197以6.0μmol/L作用24h的细胞增殖率最低(均P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,TGF-β1诱导组的细胞迁移数量为228.0±17.0个/视野,明显高于正常对照组(149.0±15.0个/视野)和TGF-β1+EW-7197处理组(46.0±8.0个/视野)(均P<0.01)。Western blot检测结果显示,TGF-β1诱导组细胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3相对表达量高于正常对照组和TGF-β1+EW-7197处理组(均P<0.001)。

结论:EW-7197能够通过TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖和迁移。

•KEYWORDS：glaucoma; EW-7197; Tenon fibroblasts; transforming growth factor-β1 (TGF-β1); scarring

0 引言

青光眼是一组由于病理性眼压升高而导致视神经损伤和不可逆视功能损害的眼病,预计2040年全球青光眼患病人数将达到1.2亿[1-2]。小梁切除术是降低青光眼患者眼压的经典手术方式,但滤过通道瘢痕化严重影响了手术成功率[3]。尽管联合使用5氟尿嘧啶或丝裂霉素C有助于抑制术后纤维细胞增生降低瘢痕化,但由于缺乏靶向性,这些药物具有诱发严重并发症的潜在风险[4]。因此探索滤过通道瘢痕化的发病机制以及研发更安全有效的药物具有重要的科学意义。国内外大量研究证实,转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)/Smad通路的异常活化参与诱导了人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts, HTFs)向肌成纤维细胞转分化,增加细胞外基质合成,是青光眼滤过手术后的组织纤维化和瘢痕收缩的重要机制之一[5]。EW-7197是一种TGF-β Ⅰ型受体(TGF-βR Ⅰ,又称为ALK5)小分子抑制剂,可以靶向拮抗TGF-β介导的信号传导,发挥抑癌效应[6]。近年研究发现,EW-7197还可以在肝脏、肾脏和肺等多器官纤维化动物模型中发挥拮抗纤维化的作用[7],但目前尚缺乏EW-7197拮抗结膜组织瘢痕化的研究。本研究拟探讨EW-7197对TGF-β1诱导的HTFs增殖和迁移的影响及相关机制,为抑制青光眼滤过术后瘢痕化提供实验依据。

1 材料和方法

1.1材料人Tenon囊成纤维细胞系(HTFs)购自上海联组生物科技有限公司(#C529);DMEM/F12培养基、青-链霉素、2.5g/L胰蛋白酶(美国Gibco公司);胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(中美合资兰州民海生物);TGF-β1(美国Peprotech公司);MTS、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)(美国Sigma公司);EW-7197(美国MedChemexpress公司);Transwell小室(美国Corning公司);兔抗人Fibronectin(ab2413)、鼠抗人α-SMA(ab5694)(美国Abcam公司);p-Smad2(#18338)、p-Smad3(#9520)单克隆抗体(美国CST公司);羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG荧光二抗(美国Licor公司);Odyssey双色红外成像系统(美国Licor公司)。

1.2方法

1.2.1 HTFs培养及分组常规培养于DMEM/F12培养基(含有10% FBS和1%青-链霉素)内,每3d传代1次,取对数期生长的细胞进行实验,培养箱内温度为37℃,CO2体积分数为5%。将细胞分为正常对照组、TGF-β1诱导组和TGF-β1+不同浓度EW-7197处理组。正常对照组为细胞培养液中添加终浓度0.5% DMSO,TGF-β1诱导组为培养基中添加终浓度0.5% DMSO和1μL TGF-β1(终末浓度为10μg/mL)。为了筛选出EW-7197的最佳作用浓度和时间,各EW-7197处理组用混合有10μg/mL TGF-β1以及不同浓度的EW-7197(1.5、3.0、6.0、8.0μmol/L)的培养基分别作用不同时间点(6、12、24h),检测细胞增殖情况。

1.2.2 MTS法测定细胞增殖率取生长状态良好的HTFs,制成细胞悬液,计数,以1×105个/毫升接种于96孔板。为了筛选最佳药物浓度及作用时间,按照1.2.1分组方案加入200毫升/孔进行培养;加入MTS 20μL,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养4h;以加入MTS溶液20微升/孔作为空白孔。采用酶标仪于490nm波长处检测各孔的吸光度值(absorbance,A值)。计算细胞增殖率=(各组A值-空白孔A值)/(正常对照组A值-空白孔A值)×100%。所有实验均独立重复3次。

1.2.3 Transwell小室检测细胞迁移取对数期生长的HTFs,制成细胞悬液,计数,以1×105个/孔铺于6孔板中;待细胞贴壁后,根据摸索出的EW-7197最佳作用浓度和时间分为3组:正常对照组为细胞培养液中添加终浓度0.5% DMSO培养24h,TGF-β1诱导组为细胞培养液中添加终浓度0.5% DMSO及10μg/mL TGF-β1处理24h,TGF-β1+EW-7197处理组为细胞培养液中添加10μg/mL TGF-β1以及6.0μmol/L EW-7197的混合液处理24h;去除原培养基,PBS清洗1次,取少量胰酶消化并收集细胞;PBS清洗细胞3次,计数,重悬于无血清DMEM/F12培养基中;在Transwell小室上室中加入100μL密度为1×105个/毫升的细胞悬液,下室加入500μL含FBS的完全培养基,置于37℃、5% CO2培养箱继续培养48h;弃去培养基,取出小室,用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞,迁移至下室的细胞用4%多聚甲醛固定5min,0.2%结晶紫染色8min,清水洗去多余结晶紫,晾干后,置于倒置显微镜下随机选取3个视野拍照,并计数发生迁移的细胞数目。所有实验均独立重复3次。

1.2.4 Westernblot分析相关蛋白表达收集1.2.3分组方案中的各组细胞,用PBS洗涤,加入RIPA裂解缓冲液溶解细胞,离心半径8cm,13 000r/min离心10min,收集上清液蛋白,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将蛋白质转印至PVDF膜。将PVDF膜置于含质量分数5%脱脂奶粉中室温封闭1h,加入质量分数5% BSA稀释的Fibronectin(1∶1000)、α-SMA(1∶1000)、p-Smad2(1∶1000)、p-Smad3(1∶1000)、Actin(1∶1000)抗体,摇床上室温孵育30min,4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,每次5min;加入相应IRDye 680CW或IRDye 800CW荧光二抗(均1∶1000),室温避光孵育1h,使用LICOR-Odyssey系统显影分析。以Actin为内参照,计算各目的蛋白相对表达量。所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 EW-7197对TGF-β1诱导HTFs细胞增殖的影响MTS实验结果表明,正常对照组、TGF-β1诱导组和TGF-β1+不同浓度EW-7197处理组在处理后不同时间点细胞增殖率总体比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。TGF-β1诱导组的细胞增殖率较正常对照组均升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。在EW-7197不同处理条件中,以6.0μmol/L EW-7197处理24h细胞增殖率最低,差异均有统计学意义(P<0.01),见表1。因此在后续实验中选择该药物浓度和作用时间。

2.2 EW-7197对TGF-β1诱导HTFs细胞迁移的影响Transwell迁移实验结果显示,正常对照组、TGF-β1诱导组、TGF-β1+EW-7197处理组细胞迁移数量分别为149.0±15.0、228.0±17.0、46.0±8.0个/视野,总体比较差异有统计学意义(F=68.091,P=0.001),其中TGF-β1诱导组细胞迁移数量较正常对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.01);TGF-β1+EW-7197处理组细胞迁移数量较TGF-β1诱导组明显减少,差异有统计学意义(P<0.001,图1)。

2.3 EW-7197对HTFs中TGF-β/Smad通路相关蛋白表达的影响Western blot检测结果显示,正常对照组、TGF-β1诱导组、TGF-β1+EW-7197处理组细胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。与正常对照组相比,TGF-β1诱导组中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(P<0.001)。与TGF-β1诱导组相比,EW-7197处理组细胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3蛋白的相对表达量明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01),见图2。

3讨论

青光眼是一组通常由于房水引流障碍导致眼内压增高引起特征性视神经萎缩和视野缺损的疾病。无论是何种类型的青光眼,积极降低眼压达到靶眼压、改善视网膜视神经血液循环、减轻视网膜神经节细胞的损害是青光眼治疗的目标[8]。小梁切除术是通过人为地开创一条滤过通道,将房水引流至巩膜瓣和结膜瓣下,以期降低眼压。但滤过泡的瘢痕化导致小梁切除术后1a的手术失败率在9.35%～17.3%,这也一直困扰着手术医生和患者[3]。迄今为止,广谱抗代谢药物5氟尿嘧啶或丝裂霉素C仍然在临床上被用作拮抗术后滤过通道瘢痕化,但这类药物存在一定的毒性或副作用,可能会引起角膜损害、低眼压综合征、眼内炎等[9]。因此,探寻毒性更低、具有靶向性抑制术后滤过通道瘢痕化的药物一直是青光眼领域研究的热点,而其中涉及揭示术后结膜组织瘢痕化的潜在机制至关重要。

表1 不同浓度EW-7197对TGF-β1诱导HTFs细胞后不同时间点细胞增殖率比较

研究发现,青光眼滤过术后HTFs会发生向肌成纤维细胞转分化,表现为细胞增殖和迁移能力增强,滤泡区域内细胞外基质大量合成堆积导致瘢痕形成[10]。在这一病理过程中,TGF-β信号通路的异常活化被认为发挥着重要的作用[11]。TGF-β是生物体内重要的细胞因子,由其介导的信号通路广泛参与细胞增殖、分化、迁移等过程,而该信号通路的异常激活已经被证实与人体多器官的纤维化存在关联性,也参与了青光眼滤过术后瘢痕化的形成[12]。在我们的研究中证实,使用外源性TGF-β1刺激HTFs后会显著增加后者的增殖和迁移能力,佐证了这一观点。因此,理论上靶向阻断TGF-β通路传导被认为可以抑制滤过术后纤维化的发生。而既往研究中应用的一些TGF-β通路抑制剂已经被证实可以减少青光眼滤过手术动物模型中滤过通道瘢痕化的面积,有利于降低术后眼压[13-17]。

EW-7197是一种新型的TGF-β通路小分子抑制剂,作用靶点是TGF-βR I(又称为ALK5),通过竞争性结合于ALK5胞内激酶结构域的ATP结合位点产生激酶抑制活性,从而能够阻断TGF-β1诱导的Smad2/Smad3蛋白磷酸化及入核,减少TGF-β通路下游与组织纤维化及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关靶基因的表达[18]。EW-7197起初被发现可以抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移以及EMT过程,近年来还被证实具有拮抗肝脏、肾脏、肺等器官动物模型纤维化的作用。诸如Park等[7]研究发现,EW-7197可以通过阻断TGF-β1/Smad2/3信号传导,降低不同器官纤维化小鼠模型中组织内胶原蛋白、α-SMA、纤连蛋白等的表达,从而发挥抗纤维化作用,延长动物模型的生存周期。Binabaj等[19]则证实,EW-7197在溃疡性结肠炎小鼠模型中可以发挥拮抗结直肠组织纤维化的作用,其机制与靶向抑制TGF-β1/Smad2/3通路,下调促纤维化基因表达,减少胶原组织在结直肠中的过度沉积有关。虽然在上述器官中,EW-7197展现了较好的抗纤维化效应,但目前尚缺乏其在眼部拮抗组织纤维化的研究。在本研究中,我们将EW-7197添加至TGF-β1诱导后的HTFs培养基中,发现可以呈浓度和时间梯度降低HTFs的细胞增殖能力。此外,使用6.0μmol/L作用浓度的EW-7197还可以显著减弱HTFs的细胞迁移能力,初步在细胞实验水平证实了EW-7197可能具有抑制青光眼滤过术后瘢痕化的作用。

为了更好地揭示EW-7197的作用机制,我们探索了该药物对HTFs中TGF-β/Smad信号通路的影响,发现EW-7197可以降低p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平,这与既往EW-7197在其他器官抗纤维化的作用机制一致[7,19],证实了EW-7197具有高度的特异性和靶向性。此外,我们还发现EW-7197可以明显降低TGF-β/Smad下游重要靶点Fibronectin和α-SMA的蛋白表达水平,后二者均属于细胞外基质的重要组成成分[20],它们的表达减弱可能导致了HTFs的迁移能力降低。此外,Fibronectin和α-SMA也是HTFs向肌纤维细胞转分化的标志[21],EW-7197对它们的抑制表达作用可能有助于减少HTFs在TGF-β1诱导后的转分化。

综上所述,本研究通过细胞实验初步证实了EW-7197具有抑制TGF-β1诱导HTFs增殖和迁移的能力,可能与下调p-Smad2、p-Smad3的蛋白,阻断TGF-β/Smad信号传导有关。接下来我们将进一步通过动物模型验证EW-7197拮抗青光眼滤过术后瘢痕化的作用,以期为探寻青光眼术后滤过通道瘢痕化的机制和药物研究提供一点参考。