生物反硝化抑制剂原花青素对土壤氮转化及植物生长的影响

刘 涛，张 萱，沈阿林，苏 瑶*

（1 浙江农林大学环境与资源学院，浙江杭州 311300；2 浙江省农业科学院环境资源与土壤肥料研究所，浙江杭州 310021；3 浙江环能环境技术有限公司，浙江杭州 310012）

氮肥施用为作物增产做出了巨大贡献，但其过量施用及其不合理的管理措施也造成了较大程度的氮肥浪费和一系列环境问题，如土壤酸化、面源污染和温室效应加剧等。据统计，2021 年我国农用化肥施用量(折纯)为5403.59 万t，其中氮肥施用量为1745.3 万t[1]，但肥料利用率偏低。目前，我国三大粮食作物(水稻、玉米和小麦)氮肥当季平均利用率仅为32%～35%[2]。优化施肥管理、提高作物氮素利用率和降低氮素环境污染成为当前我国农业绿色健康可持续发展的重要需求。

土壤反硝化过程是土壤氮循环中的重要环节，指在硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶作用下将硝态氮(NO3-)依次还原为亚硝态氮(NO2-)、一氧化氮(NO)、氧化亚氮(N2O)和氮气(N2)的过程。由于土壤反硝化过程将土壤氮素最终转化为N2O 和N2释放至大气，被认为是农业生态系统中氮素损失的重要环节之一。据统计，由土壤生物反硝化途径造成的农业生态系统氮肥损失率最高可达35.0%～52.0%[3]。另外，反硝化过程的中间产物N2O，还是造成全球变暖的重要温室气体之一，其增温潜势可达CO2的298 倍。Antonio等[4]采用15N 稳定同位素示踪技术发现，添加硝酸钾氮肥后土壤N2O 的排放有84% 以上来自反硝化作用。因此，有效调控土壤反硝化过程对于减少农业生态系统氮素损失和N2O 排放具有重要意义。

土壤反硝化的限制因子主要包括土壤氧气含量、碳氮含量、土壤 pH、温度和土壤反硝化微生物种群的组成、丰度和活性等[5]。由于土壤反硝化过程多发生于兼氧或氧气有效性受限的条件，过去大部分有关农业生态系统中土壤反硝化的研究多聚焦于水田。实际上，土壤反硝化过程同样广泛发生于旱地土壤，尤其是秸秆还田后的土壤。一方面，还田秸秆碳经转化形成土壤活性有机碳组分，可为土壤反硝化微生物提供碳源；另一方面，秸秆腐解过程消耗氧气也为反硝化过程创造了有利条件。有研究表明，长期秸秆还田下的稻-油轮作体系0—60 cm土层NO3--N 含量较不还田土壤显著减少，降幅最高可达62%，这部分NO3--N 的损失一方面来自土壤微生物对氮素的固定，另一方面则来自土壤反硝化过程引起的氮素损失，研究结果显示，还田处理组土壤反硝化微生物丰度较不还田处理增加了2.5～6.7倍[6-7]。相似的，向砂土中添加秸秆后180 天内，0—25 cm 土层NO3--N 含量下降21%～91%，而反硝化微生物活性和丰度分别增加1.9～7.8 倍和0.6～5.1 倍[8]。一般而言，旱地作物更倾向以NO3--N 作为氮素养分进行吸收转运[9]，若按传统的通过抑制硝化过程来减少氮素损失的思路，将会影响土壤NO3--N 的形成而加剧旱地土壤NO3--N 含量的减少，进而可能影响对旱地作物氮营养的供应。

近年来，通过直接抑制反硝化过程减少氮素损失作为控制旱地氮养分减损和温室气体减排的新思路已在国内外引起了一定关注。生物反硝化抑制剂，指能够抑制反硝化反应的一类植物次生代谢产物，有关生物反硝化抑制剂原花青素的研究近年来也有一定报道[10-14]。国内外学者采用土壤微宇宙培养试验、盆栽模拟试验和田间原位试验等，在不同研究尺度初步探究了原花青素施用后的土壤环境和作物生产效应，主要包括对土壤氮组分含量及N2O 排放的影响和对植物氮素积累、生物量及形态的影响等方面[11-19]。为进一步掌握生物反硝化抑制剂在农业生态系统中的应用效果与前景，本文从生物反硝化抑制剂的发现、反硝化抑制机理与效果，以及对植物生长的影响等方面的研究进展进行了系统的总结与梳理，并对其前景进行了展望。

1 生物反硝化抑制剂的发现

生物反硝化抑制剂最初主要发现于一些入侵植物，如亚洲虎杖(Fallopiaxbohemica)和蕨菜(Pteridium aquilinum)等的根部提取物，这类物质被证实可以显著抑制反硝化细菌的代谢活性，进而保障作物从土壤中获取更多的NO3--N 用于自身生长[14,20]。此后，Bardon 等[21]对这些根部提取物进行了检测分析，发现能够抑制土壤反硝化作用的代谢物质主要为原花青素。原花青素(procyanidins，简称PC)是一类多酚化合物的总称，包括儿茶素、表儿茶素、儿茶素与表儿茶素形成的二聚体、三聚体、四聚体至十聚体等[22-23]。现有研究证明，原花青素可对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、克雷伯菌(Klebsiella trevisan)、芸苔假单胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)等具有抗菌特性[21,24]，且对其反硝化作用的抑制远大于呼吸作用。Lacombe 等[25]研究表明，向4 种反硝化细菌培养物中添加浓度为0.01 mg/mL 的原花青素，不会对菌株有氧呼吸产生影响，但对其反硝化活性有所抑制；原花青素浓度提高到0.2 mg/mL，菌株生长同时受到显著抑制；但更高浓度的原花青素亦不会对部分不敏感的菌株产生生长抑制。这些研究均表明，原花青素对反硝化过程的抑制不是由于原花青素的一般抗菌特性，而是对反硝化细菌的特异性抑制作用。

2 原花青素的作用机制

作为多酚化合物中的一类，原花青素对细胞膜同样具有很强的亲和力，可以改变细胞膜的完整性和稳定性，从而有助于它们的抗菌活性[26-27]。研究表明，原花青素可被细胞膜表面吸附并进入脂质双层，进而改变细胞膜结构，影响膜通透性[19,28]。细胞膜通透性的改变可以解释高浓度原花青素的一般抗菌特性，但不能解释与有氧呼吸相比对反硝化的更高敏感性。有研究表明，低浓度的原花青素不会使Pseudomonasbrasicacearum的细胞膜发生透化，但会改变其稳定性[29]。因此，在低浓度下，反硝化作用比有氧呼吸的敏感性更高，推测可能是由于细胞膜稳定性的改变干扰了膜结合硝酸还原酶或硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白NarK 功能的发挥，由此直接或间接抑制硝酸盐还原酶或亚硝酸盐还原酶活性，形成对反硝化过程的抑制(图1)。另外，有研究指出，原花青素还可与蛋白酶发生非特异性结合[30-31]，通过将效应分子与蛋白质活性位点以外的位点结合，导致蛋白质的构象发生变化[32]，进而影响蛋白酶功能的发挥。因此，在反硝化细菌中，原花青素可能通过改变膜结合硝酸还原酶或硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白NarK 的构象而影响其活性，进而产生对反硝化过程的特异性抑制。由于周质硝酸还原酶和亚硝酸还原酶主要分布在细胞周质中，其对原花青素的抑制响应可能主要来自于硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白NarK的功能改变。因此，相较于膜结合硝酸还原酶，周质硝酸还原酶和亚硝酸还原酶对原花青素的抑制响应可能较小。不过，目前有关原花青素对反硝化过程的抑制机理还存在较多不确定的方面，有待进一步深入研究。

图1 原花青素的反硝化抑制机制假说图Fig.1 Hypothesis diagram of denitrification inhibition mechanism of procyanidins

此外，有研究证实，黄酮家族中的某些分子可以诱导或抑制细菌中的特定基因表达[33]。原花青素作为一种有着特殊分子结构的生物类黄酮混合物，也被推测可能具有抑制反硝化过程中关键功能基因表达的作用。相关研究表明[29]，Pseudomonas brassicacearum在含硝酸盐培养基中生长时，编码膜结合态硝酸盐还原酶的narG 基因表达量在暴露于原花青素时显著增加，这主要是因为细胞具有恢复酶正常活性的负反馈机制的存在；但编码亚硝酸盐还原酶的nirS 基因表达却显著减少，主要与硝酸盐还原为亚硝酸盐过程受抑制而导致亚硝酸盐含量减少有关。但是，当在含亚硝酸盐培养基中生长时，nirS表达则不随原花青素的添加而改变。这些结果表明，与反硝化过程相关的功能基因表达的变化主要与底物和产物含量变化相关，而非受原花青素的直接作用，但这些功能基因表达量的减少，会导致反硝化细菌活性的降低，进而抑制反硝化过程。

3 原花青素对土壤反硝化的影响

3.1 土壤反硝化抑制效果

基于不同试验尺度的研究结果表明，向不同质地的土壤施加原花青素均能表现出显著的反硝化抑制效果，抑制程度则与土壤特性密切相关。Galland等[19]研究结果显示，相较于有机碳含量更高的壤质砂土(9.9 g/kg)，向有机碳含量为6.9 g/kg 的砂质黏土中添加原花青素可获得更高的反硝化抑制，抑制率为24%～32%，这主要是由于原花青素可与土壤有机质强烈结合吸附，进而削弱生物活性。Ye 等[28]比较了原花青素在浙江金华(JH)和江苏金坛(JT)不同水稻土上的反硝化抑制效果，结果也显示在有机碳含量更高的JH 土壤中表现出的反硝化抑制率低于JT，反硝化抑制率分别为47.3%和57.1%。同样，原花青素的邻苯二酚基团可与土壤金属离子发生螯合作用而削弱生物活性[34]。因此，在受重金属污染以及钾、钙、镁等金属含量较高的土壤中，原花青素的反硝化抑制效果可能也会受到较大的影响。但目前，有关原花青素添加与土壤有机质及重金属间的互作机制仍有待进一步明确。此外，土壤反硝化抑制效果还与原花青素添加量及培养时间有关。相关研究结果显示，添加原花青素210 kg/hm2条件下的反硝化抑制率为32%，是添加量87 kg/hm2下的1.3 倍[19]。Ye 等[28]以水稻土为研究对象，采用室内培养试验，结果显示添加1 mg/g 干土原青花素即可对水稻土产生显著的反硝化抑制，且添加后14 天时的抑制率达到最大，此后随时间逐渐下降，这可能是由于原花青素亦可作为一种碳源和营养物质而被土壤微生物降解利用，进而其反硝化抑制效果表现为随添加时间延长而减弱[35-36]。

3.2 N2O 排放和土壤氮组分含量变化

原花青素添加至土壤后可通过抑制反硝化过程而减少其中间产物N2O 的排放量，但不同土壤的N2O 排放减少幅度仍然主要受土壤特性影响。对于反硝化活性较高的土壤，原花青素添加后的N2O 排放量减少幅度相对更高，主要与反硝化过程对N2O 的贡献大小有关[37]。

原青花素添加对土壤矿质氮组分的影响主要集中在对土壤硝态氮含量的影响上，但具体影响目前研究结果仍存在不一致之处。如Bardon 等[17]研究结果显示，在不种植作物的土壤中添加原花青素后，土壤NO3--N 含量比未添加土壤增加6 倍。而Galland等[19]对不同质地土壤的研究结果显示，向壤质砂土中添加原花青素，土壤NO3--N 含量增加113%，但对砂质黏土却无显著影响。相反的，Ye 等[28]对采自河北省秦皇岛(QHD)和浙江省金华(JH)的水稻土开展微宇宙培养试验，结果却显示添加原花青素后7 天，QHD 和JH 土壤中的NO3--N 含量显著下降。由于土壤NO3--N 同时参与土壤硝化、反硝化、硝酸盐异化还原为铵以及微生物同化等多个氮转化过程，因此其含量的变化与这些过程的活性均有关系。一方面，原青花素的添加可通过抑制土壤反硝化过程而减少土壤NO3--N 的损失；另一方面，也可能通过增强硝酸盐异化还原为铵或土壤微生物同化作用，使土壤NO3--N 进一步转化为土壤可储存的氮而增加NO3--N 的转化。目前，有关原花青素添加后对农田土壤硝酸盐异化还原为铵和土壤微生物同化过程的影响还鲜有报道，相关机制还不清楚，未来可结合15N 稳定同位素标记技术、现代分子生物学以及组学技术等，进一步全面揭示原花青素添加后对土壤氮转化过程的影响机制，以助于全面把握原花青素对土壤可利用氮水平的影响，进而指导作物氮养分管理。

3.3 土壤反硝化细菌丰度与种群结构变化

较低剂量(＜83 kg/hm2)的原花青素添加对土壤中反硝化细菌的丰度不会产生显著影响，但当原花青素施入量增加至210 kg/hm2时，土壤中nirK 型和nirS 型反硝化细菌丰度分别减少33%～45%和44%～67%，根际土壤反硝化细菌相对丰度减少4.5 倍[19]。Ye 等[28]研究结果显示，与对照相比，添加原花青素可减少供试土壤nirS clade I、nirS clade II 和nirK clade III 的种群数量，减少比例在10%～25%左右，但对nirK clade I 数量的影响在不同土壤中表现有所不同。这表明，原花青素可对nirS-/nirK-反硝化菌不同clade 产生不同程度的影响。反硝化细菌对原花青素的不同响应模式可能与土壤中反硝化细菌种群组成差异有关，而这种差异则主要受土壤特性的影响，如土壤pH、有机质含量、氮含量等[19,38-39]。此外，Hugoni 等[16]研究结果表明，原花青素的添加并不会显著改变土壤细菌和真菌的群落组成和多样性，也不影响土壤中非目标微生物种群的功能；但原花青素添加会改变不同土壤中微生物间的相互作用，表现为不同种属的微生物在添加原花青素后发生富集的情况不同，如砂质黏土中Entotheonellaeota和Mucoromycota有所富集，而在壤质砂土中则是Dependentiae和Rozellomycetes有所富集。

4 原花青素对植物生长的影响

4.1 植物地上和地下部生物量变化

添加原花青素可通过减少土壤氮素损失，增加对植物养分的供应，保障植物生长所需，进而增加植物(如芹菜、生菜、莴苣)可食部分和根部的生物量[19,28,40]。Galland 等[18]设置施入不同含量及次数的氮肥与原花青素试验，结果显示，施肥处理较添加原花青素更能促进芹菜的生长，与未添加原花青素相比，原花青素添加可增加芹菜可食部分的鲜重47%～83%，同时增加株高37%～52%，相较于2 次原花青素施用，1 次施用下鲜重增加更多，但株高增加幅度较小。Galland 等[41]试验表明，与未添加原花青素相比，施用210 kg/hm2的原花青素，生菜可食部分鲜重显著增加16%。施用 83 和210 kg/hm2的原花青素，生菜根部鲜重分别增加39%和63%，根部干重分别增加52%和97%。此外，添加原花青素还可增加植物枝条47%[18]。由此可见，原花青素的添加量是影响植物生物量增加幅度的重要因子，但有关原花青素添加量与植物生长间存在怎样的剂量关系仍不明确，需要结合特定土壤、施肥水平、肥料类型等开展系统的试验以确定，进而指导实际生产中原花青素的科学施用。

4.2 植物组织氮含量变化

研究显示，添加210 kg/hm2的原花青素可增加生菜可食部分氮含量，平均每棵增加N 3.6 g，但随添加的原花青素浓度的增加，生菜可食部分氮含量从2.1%降至1.8%[41]。Galland 等[18]研究结果显示，未经处理的芹菜中氮含量约为1.3%，添加原花青素后芹菜根部氮含量较未添加处理无显著变化或略有减少。另有研究指出，添加原花青素后，作物的叶片、茎和根等组织中的氮含量均不会发生显著变化[17,42]。这些研究结果表明，原花青素的添加可能只是为植物提供了更多的NO3--N，但并没有显著改变植物对氮养分的吸收转运能力，进而在植物组织中并未出现N 的积累。但原花青素添加后引起的土壤可利用氮水平的改变也可能会间接影响植物次级代谢产物的合成。Cerovic 等[43]研究表明，当植物不受土壤低氮胁迫时，叶绿素水平相对较高，植物将合成更多的初级代谢产物；然而在氮缺乏的条件下，植物可通过合成相对更多的类黄酮等次级代谢产物来应对环境变化而带来的生长胁迫[44]。目前，鲜有关于原花青素添加对植物次级代谢产物合成与分泌影响的报道，而植物次级代谢产物与植物免疫能力、植物品质等密切相关。因此，今后仍有必要进一步解析，在不同地力条件下添加原花青素对植物免疫及品质等方面的影响及其相关机制。

4.3 植物组织形态变化

氮的有效性可强烈影响植物的形态特征，特别是根的形态特征，它同时受到外部NO3-供应和内部NO3-的强烈影响[45-48]。与NO3-直接接触可刺激侧根尖端的分生组织活动，从而诱导侧根增殖并增加对根的生物量分配；但是，枝条中一定水平的 NO3-作为根分枝的系统抑制剂，可能会降低对根的生物量分配[41,49-50]。Bardon 等[17]研究显示，在土壤中添加原花青素后38 天，未观察到亚洲虎杖(Fallopiaxbohemica)高度和总干生物量的变化，却发现其根茎质量比随着原花青素的添加量增加而增加。Zhao 等[37]也发现，添加原花青素的植物比在施用肥料后根比芽发育得更多。由此推测，原花青素添加有利于植物根系的发育与生长，一方面，原花青素通过限制NO3-损失，增加了根与NO3-之间的直接接触，从而诱导植物在含NO3-的区域集中新的和更多的根系生长；另一方面，添加原花青素后未观察到叶片和茎中 NO3--N 积累，因此也并未对根的生物量分配产生抑制。

5 展望

目前，有关生物反硝化抑制剂的研究尚处于起步阶段，尽管已基本明确了原花青素在土壤氮素减损、N2O 减排和植物增产方面的有益效果，但仍需深入开展许多有关生物反硝化抑制剂的基础和应用研究：

1)进一步探索生物反硝化抑制剂施用后对土壤氮素转化的影响机制，一是结合稳定同位素示踪技术、现代分子生物学技术和组学技术等，解析土壤微生物氮同化和硝酸盐异化还原为铵过程对原花青素添加的响应，阐释土壤有效氮水平变化的微生物机理；二是研究在不同土壤条件下施用原花青素的效果差异，解析原花青素与土壤活性颗粒的互作机制。

2)明确原花青素施用量与植物产量间的剂量关系，并深入研究生物反硝化抑制剂施用对植物生长影响的分子机理，重点围绕植物营养吸收转运、次级代谢产物合成与分泌、植物免疫与品质等方面阐释原花青素添加的影响及机制，为指导原花青素施用作为植物生产过程中的肥料管理措施提供理论依据和数据支撑。

3)开发基于原花青素的新型稳定性肥料产品或土壤改良产品，并相继开展田间效果评估。基于生物反硝化抑制剂的新型肥料或土壤改良产品将以其环境友好的特点，在未来绿色健康农业发展中具有广阔的应用前景，也将对我国化肥减施增效和农产品品质安全的提升等产生重大意义。