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羟氯喹抑制TLR9/MyD88/NF-κB 通路减轻系统性红斑狼疮小鼠肾损伤作用

2023-09-26王莉平郭金明付永涛张娜张红霞许冰

现代药物与临床 2023年8期
关键词:氯喹红斑狼疮肾小管

王莉平,郭金明,付永涛*,张娜,张红霞,许冰

1.邯郸市中心医院,河北 邯郸 056001

2.石家庄市第四医院,河北 石家庄 050000

3.邯郸市邯钢医院,河北 邯郸 056001

系统性红斑狼疮是一种较常见的慢性自身免疫性疾病,男女患者比例约1∶9,以20~40 岁育龄期女性较为多见[1]。系统性红斑狼疮呈反复发作、迁延难愈的特点,可导致多脏器损伤,有文献报道超过70%的系统性红斑狼疮患者并发不同程度肾损伤,其中约20%的患者最终发展为终末期肾病,是导致系统性红斑狼疮患者死亡的主要因素[2]。系统性红斑狼疮病理机制复杂,其中炎症反应是系统性红斑狼疮所致多脏器并发症发生发展的关键因素。研究证实,肾炎是系统性红斑狼疮肾损伤发展为终末期肾病的重要病理通路[3-4]。Toll 样受体9/髓样分化因子88/核因子-κB(TLR9/MyD88/NF-κB)是机体炎症反应机制中重要的信号传导通路,有文献报道通过抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信号通路及其介导的炎症反应,可有效减轻系统性红斑狼疮所致肾损伤[5-7]。

羟氯喹化学结构属于4-氨基喹啉衍生物,临床上常用于类风湿关节炎以及潜在不良反应较小药物疗效不佳的盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮的治疗。研究证实,羟氯喹具有抑制系统性红斑狼疮所致视网膜病变、动脉粥样硬化等并发症的作用[8-9],并且羟氯喹能够通过抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信号通路相关蛋白表达对小鼠肠炎和肝缺血再灌注损伤起到保护作用[10-11]。但羟氯喹是否能通过TLR9/MyD88/NF-κB 信号通路对系统性红斑狼疮所致肾损伤起到治疗作用尚未见文献报道,本研究通过制备系统性红斑狼疮小鼠模型,探讨羟氯喹对系统性红斑狼疮小鼠肾损伤的影响,并基于TLR9/MyD88/NF-κB 信号通路探索其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

45 只清洁级雌性BALB/c 小鼠,7~8 周龄,体质量19~22 g,购自河北伊维沃生物科技有限公司[SCXK(冀)2020-002]。在12 h/12 h 光暗交替、室温23~25 ℃、相对湿度45%~65%的条件下饲养,自由进食饮水。实验过程遵循减少、替换、优化的原则给予实验动物人道主义关怀。实验方案获得邯郸市中心医院伦理委员通过,伦理批件号HDZXLL(K)2022-013。

1.2 药物和试剂

硫酸羟氯喹片(上海上药中西制药有限公司,规格0.1 g,批号2021S03018);TLR9 抑制剂ODN2088(美国CST 公司,批号21A004F27);降植烷(美国Sigma 公司,批号07162S);ELISA 法抗双链DNA(ds-DNA)抗体检测试剂盒(北京华英生物技术研究所,货号HY-2458);磺基水杨酸法尿蛋白(UTP)、分光光度法血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)试剂盒(北京索莱宝公司,货号BC8141、BC4910、BC1530、SEKM-0031、SEKM-0034、SEKM-0004、SEKM-0007);苏木精-伊红染色法(HE)试剂盒(上海碧云天生物科技公司,货号C0105M);Masson染色试剂盒、IgG 二抗、ECL 显色液(北京博奥森生物技术公司,货号S0075、bs-0293P、C05-07004);逆转录试剂盒、RT-PCR 扩增试剂盒、TRIzol 试剂、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司,货号RP1100、RP1105、R1100、R0010、PC0020);TLR9、MyD88、NF-κB p65、β-actin 抗体(美国Santa Cruz 公司,货号sc-52966、sc-37016、sc-54135、sc-13074)。

1.3 主要仪器

AU-480 型全自动生化分析仪(美国Beckman公司);1510 型酶标仪(美国Thermo Fisher 公司);RM2245 型石蜡组织切片机(德国Leica 公司);MIKRO 220R 型高速冷冻离心机(德国Hettich 公司);QuantStudio 5 型PCR 仪(美国ABI 公司);552BR 型电泳仪(美国Bio-Rad 公司);DYY-7C 型转模仪(北京六一生物技术公司);5200 型化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 造模、分组与给药 随机取45 只BALB/c 小鼠中的8 只设为对照组,剩余37 只则参照马松鹤等[12]报道的方法,通过ip 降植烷0.5 mL 构建系统性红斑狼疮小鼠模型,6 个月后血清ds-DNA 抗体水平显著升高且尿蛋白呈强阳性(++++),则可判定系统性红斑狼疮小鼠模型构建成功[12]。共成模33 只,去除ds-DNA 抗体水平最低的1 只后,将剩余的32 只成模小鼠随机分为模型组、羟氯喹组、ODN2088 组、硫酸羟氯喹片+ODN2088 组,每组8 只。羟氯喹组ig 80 mg/kg(根据人与小鼠剂量换算公式计算所得),ODN2088 组ip 给药4 mg/kg[13],羟氯喹+ODN2088 组ig 硫酸羟氯喹片80 mg/kg 和ODN2088 4 mg/kg,对照组和模型组ig 给予生理盐水,各组均1 次/d 给药连续治疗5 周。

1.4.2 标本采集 末次给药2 h后称量大鼠体质量,每隔2 h 通过按压腹腔收集尿液,共收集24 h 的尿液备检。通过摘眼球取血1 mL 后离心(2 000 r/min,5 min)取血清,-20 ℃保存备检。颈椎脱臼处死后,开腹取双侧肾脏,4 ℃生理盐水冲洗干净后称量双侧肾质量,然后左侧肾脏-20 ℃保存备检,右侧肾脏置于10%中性甲醛溶液实施固定。

1.4.3 肾脏指数(RI)按照以下公式计算RI。

RI=双侧肾质量/体质量

1.4.4 24 h-UTP 及血清Scr、BUN 水平检测 取收集的24 h 尿液,遵照试剂盒说明处理后,采用磺基水杨酸法检测24 h-UTP 含量。取血清,遵照试剂盒说明进行处理后,采用分光光度法检测血清Scr、BUN 水平。

1.4.5 肾组织病理学检查及纤维化状况观察 取经10%中性甲醛溶液固定72 h 后的右侧肾脏,梯度乙醇溶液脱水处理后浸蜡包埋,4 μm 厚度连续切片、贴附于涂有多聚赖氨酸的防脱载玻片上,经梯度乙醇溶液脱蜡水化后按照试剂盒操作说明行HE染色,显微镜观察肾组织病理学改变,参照王双[14]报道的方法进行病理评分,即(1)肾小球病理评分:未见异常,记0 分;出现系膜增生、炎性细胞浸润,为轻度,记1 分;在轻度基础上出现内皮细胞增生,为中度,记2 分;在中度基础上出现新月体样病变,为重度,记3 分。(2)肾小管病理评分:未见异常,记0 分;受损肾小管数量占肾小管总数<25%、25%~50%、>50%~75%、>75%分别记1、2、3、4 分。

按照试剂盒操作说明行Masson 染色,显微镜下观察肾组织纤维化状况,Masson 染色图片中蓝色为胶原纤维着色计算胶原容积分数(CVF)。

CVF=蓝染面积/总面积

1.4.6 肾组织IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 检测 取部分左侧肾组织,加入适量生理盐水后研磨匀浆,离心(3 500 r/min,10 min)取上清液,遵照试剂盒说明进行处理后,采用ELISA 法检测肾组织IFNγ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平。

1.4.7 肾组织TLR9、MyD88、NF-κBp65 mRNA 表达检测 取部分左侧肾组织剪碎后,加入4 ℃TRIzol试剂提取肾组织总RNA,逆转录合成cDNA,然后以cDNA 为模板通过PCR 仪行基因扩增反应,反应条件设置:95 ℃预变性2 min,然后95 ℃变性15 s、55 ℃退火15 s,共进行40 个循环。β-actin作为内参以公式2-ΔΔCt计算TLR9、MyD88、NF-κB p65mRNA 相对表达量。PCR 引物由生工生物工程(上海)公司提供,引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.8 肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白表达检测 取左侧肾组织100 mg,加入1 mL 4 ℃ RIPA裂解液研磨匀浆提取总蛋白,BCA 法检测蛋白浓度,均取30 μg 蛋白量上样,通过10% SDS-PAGE电泳分离蛋白、转PVDF 膜、室温5%脱脂奶粉封闭1.5 h 后,加TLR9(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶800)、β-actin(1∶2 000)抗体稀释液4 ℃孵育过夜,洗膜后二抗(1∶2 000)稀释液室温孵育1 h,洗膜后ECL 显影,蛋白相对表达量以其与内参蛋白(β-actin)灰度值比值表示。

1.5 统计学处理

运用统计学软件SPSS 20.0 进行处理。计量资料符合正态分布以表示,多组间均数行单因素方差分析,两组间比较行LSD-t检验。

2 结果

2.1 羟氯喹对小鼠体质量和RI 的影响

与对照组比较,模型组体质量显著降低,RI 显著升高(P<0.05)。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组体质量显著升高,RI 显著降低(P<0.05)。与羟氯喹组和ODN2088组比较,羟氯喹+ODN2088 组体质量显著升高,RI显著降低(P<0.05),见图1。

图1 羟氯喹对小鼠体质量和RI 的影响(,n=8)Fig.1 Effects of hydroxychloroquine on body mass and RI in mice (,n=8)

2.2 羟氯喹对小鼠24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平的影响

与对照组比较,模型组24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平显著降低(P<0.05)。与羟氯喹组、ODN2088 组比较,羟氯喹+ODN2088组24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平显著降低(P<0.05),见图2。

图2 羟氯喹对小鼠24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平的影响(,n=8)Fig.2 Effects of hydroxychloroquine on 24 h-UTP and the level of Scr,BUN in serum in mice (,n=8)

2.3 羟氯喹对小鼠肾组织病变的影响

对照组小鼠肾组织形态结构未见病理性改变。模型组小鼠肾组织呈现明显的病理性改变,包括肾小球系膜增生、炎性细胞浸润、内皮细胞增生以及新月体样病变;肾小管上皮细胞空泡样变、坏死呈颗粒状;肾间质炎性细胞浸润。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组肾组织病理性改变均明显改善,其中羟氯喹+ODN2088组效果优于羟氯喹组和ODN2088 组。

与对照组比较,模型组肾小球和肾小管病理评分显著升高(P<0.05)。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组肾小球和肾小管病理评分显著降低(P<0.05)。与羟氯喹组和ODN2088 组比较,羟氯喹+ODN2088 组肾小球和肾小管病理评分显著降低(P<0.05),见图3、4。

图3 羟氯喹对小鼠肾组织病变的影响(HE 染色,×400)Fig.3 Effects of hydroxychloroquine on renal histopathological changes in mice (HE staining,×400)

图4 羟氯喹对小鼠肾组织肾小球和肾小管病理评分的影响(,n=8)Fig.4 Effects of hydroxychloroquine on the pathological scores of glomeruli,renal tubules in mice (,n=8)

2.4 羟氯喹对小鼠肾组织纤维化的影响

对照组小鼠肾组织肾小球系膜区和肾小管周围间质区可见少量散在分布的胶原纤维。与对照组比较,模型组小鼠肾组织胶原纤维明显增多,以肾小管周围间质区胶原纤维沉积最多。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组胶原纤维明显减少,其中羟氯喹+ODN2088 组效果优于羟氯喹组和ODN2088 组。

与对照组比较,模型组肾组织CVF 显著升高(P<0.05)。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组CVF 显著降低(P<0.05)。与羟氯喹和ODN2088 组比较,羟氯喹+ODN2088组CVF 显著降低(P<0.05),见图5、6。

图5 羟氯喹对小鼠肾组织纤维化的影响(Masson 染色,×400)Fig.5 Effects of hydroxychloroquine on renal fibrosis in mice (Masson staining,×400)

图6 羟氯喹对小鼠肾组织CVF 的影响(,n=8)Fig.6 Effects of hydroxychloroquine on renal CVF in mice(,n=8)

2.5 羟氯喹对小鼠肾组织IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平的影响

与对照组比较,模型组肾组织IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平显著升高,IL-2 水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组肾组织IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平显著降低,IL-2 水平显著升高(P<0.05)。与羟氯喹组和ODN2088 组比较,羟氯喹+ODN2088 组肾组织IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平显著降低,IL-2 水平显著升高(P<0.05),见图7。

图7 羟氯喹对小鼠肾组织IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平的影响(,n=8)Fig.7 Effects of hydroxychloroquine on the level of IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-4 in renal tissue in mice (,n=8)

2.6 羟氯喹对小鼠肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65 mRNA 表达的影响

与对照组比较,模型组肾组织TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相对表达量显著升高(P<0.05)。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组肾组织TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相对表达量显著降低(P<0.05)。与羟氯喹组或ODN2088 组比较,羟氯喹+ODN2088 组肾组织TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相对表达量显著降低(P<0.05),见图8。

2.7 羟氯喹对小鼠肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白表达的影响

与对照组比较,模型组肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。与模型组比较,羟氯喹组、ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。与羟氯喹组和ODN2088 组比较,羟氯喹+ODN2088 组肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),见图9、10。

图9 羟氯喹对小鼠肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白表达的影响Fig.9 Effects of hydroxychloroquine on the expression of TLR9,MyD88,NF-κB p65 proteins in renal tissue in mice

图10 羟氯喹对小鼠肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量的影响(,n=8)Fig.10 Effect of hydroxychloroquine on the relative expression of TLR9,MyD88,NF-κB p65 proteins in renal tissue in mice (,n=8)

3 讨论

系统性红斑狼疮动物模型主要有自发型、诱发型、基因调控型3 类,其中诱发型具有操作简单易行、成模周期短、经济适用且与人类系统性红斑狼疮病理特征接近的优势,是系统性红斑狼疮相关动物实验研究常用且普遍认可的造模方法,降植烷是最常用的诱发剂[15]。本研究结果显示,系统性红斑狼疮模型小鼠体质量降低,RI、24 h-UTP、血清Scr、BUN 水平升高,肾组织呈现肾小球系膜和内皮细胞增生、新月体样变、炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞空泡样变、坏死呈颗粒状,肾间质炎性细胞浸润、胶原纤维沉积,与马松鹤等[12]和谈欣怡等[16]报道一致。经羟氯喹治疗可显著提高系统性红斑狼疮小鼠体质量,降低RI、24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平,明显改善系统性红斑狼疮小鼠肾组织病变和纤维化状况,降低肾小球、肾小管病理评分和CVF,该结果与王蕊等[17]研究结果相似。表明羟氯喹对系统性红斑狼疮小鼠肾损伤具有保护作用,对肾功能具有改善作用。

系统性红斑狼疮是与环境、遗传、免疫、激素等多因素相关的一种自身免疫性疾病,研究证实,T 细胞和B 淋巴细胞异常活化导致免疫功能紊乱及免疫复合物沉淀,进而引发IFN-γ、TNF-α、IL-4 等炎症因子大量分泌是系统性红斑狼疮及其并发症进行性加重的重要机制[18]。TNF-α 具有炎性趋化属性,可诱导炎症因子进一步释放而加重炎症反应,并促进炎性浸润。此外,IFN-γ 被视为系统性红斑狼疮病理机制的中枢介质,De Ceuninck 等[19]报道靶向抑制IFN-γ 对自身免疫性疾病具有一定的治疗作用;IL-4 可促进B 细胞活化,Gao 等[20]报道系统性红斑狼疮活动性与IL-4 水平升高相关;IL-2 对系统性红斑狼疮进展表现为逆向调控作用,Miao 等[21]报道给予少量IL-2 对系统性红斑狼疮患者具有一定的治疗作用。本研究发现,经羟氯喹治疗可显著降低系统性红斑狼疮小鼠肾组织IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平,并提高IL-2 水平,这可能是羟氯喹对系统性红斑狼疮小鼠肾损伤起到保护作用的重要机制。

Toll 样受体(TLRs)是一类跨膜识别受体,其中TLR9 在系统性红斑狼疮患者B 淋巴细胞中高表达,有文献报道TLR9 高表达为系统性红斑狼疮疾病进展的危险因素[22]。NF-κB 为TLRs 下游靶蛋白,TLR9 可通过做为信号传导介质的MyD88 诱导NFκB 表达与活化,活化型NF-κB 核转位后NF-κB p65亚基通过与DNA 特定位点结合而诱导IFN-γ、TNFα、IL-4 等因子转录表达,进而诱导炎症反应[23]。本研究发现,经羟氯喹治疗可显著降低系统性红斑狼疮小鼠肾组织TLR9、MyD88、NF-κB p65 mRNA 和蛋白表达量,提示羟氯喹抑制系统性红斑狼疮小鼠肾脏炎症反应可能与抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信号通路有关。该结果与吴琼等[6,24]研究结果相似。为了证实上述推论,本研究设置了TLR9 抑制剂ODN2088 组和羟氯喹+ODN2088 组,结果显示,ODN2088 组对系统性红斑狼疮小鼠肾功能、肾组织病变、炎症反应相关指标以及TLR9/MyD88/NF-κB信号通路的调控方向与羟氯喹组相同,且羟氯喹+ODN2088 组对系统性红斑狼疮小鼠各检测指标的调控作用显著优于羟氯喹组和ODN2088 组,从而进一步证实羟氯喹对系统性红斑狼疮小鼠肾损伤的保护作用与抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信号通路有关。

综上所述,羟氯喹对系统性红斑狼疮小鼠肾损伤具有保护作用,对其肾功能具有改善作用,其机制可能与抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信号通路,减轻炎症反应有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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