透明质酸的抑菌性能及在干酪制品中的应用

柴云雷 郭 丽 张雅娜 郭 齐

（绥化学院食品与制药工程学院 黑龙江绥化 152061）

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种大分子线性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基氨基-D-葡萄糖二糖单位交替连接组成，它广泛存在于高等动物的各种组织中，不同组织中含量不同，其中眼玻璃体、皮肤、脐带和关节滑液中含量较高[1]。HA为大分子物质，其相对分子量（relative molecular mass，Mr）大约为5～20000 kDa，因其分子中含有大量羟基和羧基，所以具有极强的保水作用[2]。此外HA还具有良好的抗炎促修复、调控细胞增殖、分化和迁移等作用。不同生物体，不同组织来源的HA其分子量大小不同，发挥作用也不同[3]。研究表明，高Mr的HA能够刺激抗炎症反应，抑制细胞增殖、分化和迁移，抑制血管和颗粒组织生成。反之，低Mr 的HA 会增强促炎症基因的表达，诱导细胞增殖，促进血管生成[4-6]。目前关于HA的研究还主要集中在医学和化妆品方面，而其它方面的性能还有待进一步研究。

干酪（又称奶酪）是指在乳中（也可以是脱脂乳或稀奶油）中加入适量发酵剂和凝乳酶使乳蛋白质凝固，排除乳清后，将凝块压成所需性状而制成的产品[7]。干酪可以说是纯奶的浓缩，因而含有的营养物质更加丰富，极易被微生物污染发生变质，所以一般通过添加食品防腐剂来延长食品保质期。考虑到化学合成类添加剂的安全隐患，近年来研究者更多将目光投向天然提取类物质，如，在奶酪制品中添加纳他霉素。有报道称HA具有抑菌性[8]，但其抑菌性的研究主要集中在与其他物质的结合方面，如，Jayesh 等[9]在将HA 与头孢西丁钠复合研究抑菌性，Sara 等[10]在将HA 与壳聚糖复合研究其抑菌功效等。而单独研究HA抑菌性的几乎没有，再结合HA的性能与相对分子量和浓度相关这一特点，因此，本文将不同Mr 不同浓度的HA 进行抑菌性能的比较研究，并将HA应用于干酪制品中测定其抑菌效果，该研究对进一步了解、开发和应用透明质酸提供了一定的理论依据，同时为天然型防腐剂的选择打开新思路。

一、材料和方法

（一）材料和试剂。高Mr（1800-2200 kDa）、中Mr（1300-1500 kDa、800-1000 kDa）和低Mr（200-400 kDa）的透明质酸粉末[11]：山东福瑞达生物医药有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和志贺氏菌（Shigella）：绥化市食品药品检验检测所；啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：百威英博哈尔滨啤酒有限公司；马铃薯、妙可蓝多马苏里拉干酪（原制干酪）、妙可蓝多奶酪棒（再制干酪）：市售。

牛肉膏：北京路桥技术有限责任公司；蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、氯化钠：天津市天力化学试剂有限公司；平板计数琼脂培养基（PCA）：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。以上试剂均为分析纯。

（二）仪器和设备。XFH-30L高压蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；DHP-9162电热恒温培养箱：上海-恒科学仪器有限公司；XH-C旋涡混合器：金坛市白塔新宝仪器厂：752紫外-可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。

（三）透明质酸抑菌性能的比较。

1.透明质酸抑菌作用的测定。

（1）培养基的配制。马铃薯葡萄糖培养基：将马铃薯去皮切成小块，称取200 g放入锅中，加1000 mL蒸馏水，在电炉上加热至沸腾，维持25 min后，趁热用2层纱布过滤，弃去滤渣，在滤液中加入20 g葡萄糖溶解后，加蒸馏水补至1000 mL，固体培养基另加20 g琼脂粉，pH自然，放入高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌15 min，用于培养啤酒酵母。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加入蒸馏水溶解定容至1000 mL，固体培养基另加20 g琼脂粉，调pH 7.0～7.2，121℃灭菌15 min，用于培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌。

（2）菌种纯化及菌悬液的制备。从-80℃冰箱中取出各菌种放在4℃冰箱中备用，在无菌操作环境下，用接种环蘸取一环菌种，在固体平板培养基上划线，倒置于培养箱中培养。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌划线在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，37℃培养24 h，啤酒酵母划线在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃培养48 h。然后分别挑取单菌落接种于相应液体培养基中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌37℃培养18 h，啤酒酵母28℃培养24 h。最后用接种环蘸取菌液划线于相应的试管斜面，培养后放入4℃冰箱备用。

使用前，在无菌条件下挑取一环接种于5 mL无菌生理盐水中，涡旋混匀后制成菌悬液。

（3）滤纸片法测定透明质酸的抑菌作用。称取不同质量（0.015 g、0.010 g、0.005 g）HA粉末溶解于10 mL无菌水中，放置在4℃冰箱中溶解分别制备成浓度为15 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL的溶液。吸取100 μL的菌悬液接种到相应固态培养基中，用涂布棒涂布均匀。将滤纸用打孔器制成直径6 mm的滤纸片若干，放入培养皿中高压灭菌，干燥器中干燥后，分别放入不同浓度的HA 溶液中浸泡20 min，沥干后用镊子均匀铺在培养基上[12]。每个培养基中放入5 个滤纸片。其中1、2、3 号用同一HA溶液浸泡作为平行试验，4号用75%乙醇浸泡为阳性对照，5号用无菌水浸泡为阴性对照。处理好的培养皿倒置于培养箱中，细菌在37℃培养24 h，真菌在28℃培养36 h，培养后用游标卡尺量取抑菌圈直径（mm），结果取平均值。

2.透明质酸最小抑菌浓度的测定。采用试管二倍稀释法将不同Mr 的HA 分别配制成浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009 mg/mL 的溶液，依次取5 mL各浓度HA溶液于11支无菌试管中，再各加入0.5 mL菌悬液和5 mL 对应的无菌液体培养基[13]。0 号阴性对照管中加入5.5 mL无菌水和5 mL对应的液体培养基，12号阳性对照管中加入5 mL无菌水、5 mL对应的液体培养基和0.5 mL菌悬液。

将处理后的样品分别放入各菌种培养条件下培养24～36 h。结束后观察试管浑浊情况并在600 nm波长下测定此时溶液的吸光度值。若液体澄清且吸光度值接近阴性对照，此时对应的HA溶液最小浓度即为MIC值。

（四）透明质酸在干酪制品中的抑菌作用。取700 g干酪制品，均分成14份且形状为见方形，标号为1～14号。其中1～7号样品作为对照组不添加HA。8～14号样品作为试验组，均在干酪制品表面涂抹1.5 mL高Mr、浓度为10 mg/mL的HA溶液。将制备好的样品用灭菌的玻璃广口瓶密封包装，室温存放。然后分别在放置的第1、2、3、4、5、6、7 d从对照组和试验组中各取1个样品进行菌落总数的测定，测定方法依据国家标准GB 4789.2-2016中的平板计数法[14]。

（五）数据处理。试验均重复3次，结果表示为“平均值±标准偏差（Means±SD）”，采用OriginPro 8.5.1 软件进行绘图，SPSS Statistics 20.0 软件进行单因素ANOVA 分析和Tukey 多重比较分析，P＜0.05表示差异显著。

二、结果与分析

（一）透明质酸抑菌作用的试验结果。中Mr（1300-1500 kDa）、浓度为15 mg/mL的HA溶液，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和志贺氏菌的抑菌效果见图1。

图1 中相对分子量HA对不同菌种抑菌圈效果图

为直观清晰比较不同Mr、不同浓度的HA溶液对四种供试菌的抑菌作用，将抑菌结果制成表1～表4。

表1 高Mr（1800-2200kDa）透明质酸抑菌试验结果比较

表2 中Mr（1300-1500 kDa）透明质酸抑菌试验结果比较

表3 中Mr（800-1000 kDa）透明质酸抑菌试验结果比较

表4 低Mr（200-400 kDa）透明质酸抑菌试验结果比较

由表1可知，对照组无菌水抑菌圈直径为6mm，且对不同菌株之间无显著性差异，说明试验结果有效可行。高Mr（1800-2200 kDa）的HA不同浓度的抑菌圈直径均大于6 mm，说明HA具有抑菌性。这与钟良军发现结果相符，陈菲等[15]在研究HA与盐酸米诺环素联合抑菌时，发现单独HA也具有抑菌作用，这也与本研究结果一致。抑菌圈直径在不同浓度和不同菌种之间的ANOVA 分析中均有显著性差异，说明其抑菌效果与之相关。同一菌种不同浓度的HA 其抑菌性表现为：10%＞5%＞15%，且抑菌性均大于75%乙醇。HA随分子量增大，分子体积也增大，因其强大的吸水性，使体积增大速率会更快，是分子量增大的1.8倍，使溶液粘度增加，而有限的空间HA链拥挤在一起，使其不利于与微生物接触并起到抑制作用[16]。同样溶液浓度增大也会使溶液粘度增大，大分子聚集，不利于抑制微生物生长。所以高Mr 的HA 在高浓度时抑菌性降低。而在低浓度时，虽然HA分子量较大，但仍可以单体状态存在，与微生物较好的接触并抑制其生长。同一浓度HA对不同菌种的抑菌性表现为：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志贺氏菌，Ardizzoni等[17]在研究HA抑菌能力时，证明了HA对不同微生物菌属有不同的抑菌能力，这与本试验结果一致。但由于试验菌种较少，不能判断HA的抑菌规律，可通过后续扩大菌种范围进一步研究。

由表2和表3可知，中Mr的HA具有抑菌性，且抑菌性仍大于75%乙醇。同一菌种不同浓度HA 的抑菌性表现为：15%＞10%＞5%，因为HA分子量下降，体积减少，溶液粘度降低使其能在溶液中较好的分散，即使在较高浓度下仍能以单体状态存在并发挥抑菌作用。但中Mr（1300-1500 kDa）的HA（15%浓度）其抑菌性略低于高Mr的HA（10%浓度），可在后续将中Mr的HA溶液浓度提高做进一步研究。综合表1，表2，表3可知，HA 随Mr 下降其抑菌性能降低。在差异性比较中也发现，HA随Mr下降，不同浓度间抑菌圈直径的差异性降低，且与75%乙醇的抑菌性差距缩小。同一浓度HA溶液对不同菌种的抑菌性仍表现为：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志贺氏菌。

由表4可知，低Mr的HA同样具有抑菌性，但这与沙坤等认为的HA 的低Mr 与高Mr 在性能方面相反的这一说法不同，原因是目前对于低Mr的HA定义还很模糊，在不同研究中HA分子量从少量双糖到700 kDa均有用“短片段HA”、“低分子量”和“HA 寡糖”来进行描述，因此对于低Mr 的HA 在性能上会存在差异。但由表4可知，低Mr的HA抑菌性能明显降低，这与之前分析的分子量下降抑菌性能降低结果一致。不同浓度的HA其抑菌性同样表现为：15%＞10%＞5%，且10%的抑菌性能与75%乙醇相近，5%的抑菌性能低于75%乙醇。HA对不同菌种的抑菌性表现为：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志贺氏菌。

（二）透明质酸MIC测定试验结果。不同Mr的HA对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和志贺氏菌的MIC 结果见表5～表8。

表5 高Mr（1800-2200 kDa）MIC测定结果

表6 中Mr（1300-1500 kDa）MIC测定结果

表7 中Mr（800-1000 kDa）MIC测定结果

表8 低Mr（200-400 kDa）MIC测定结果

由表5 可知，高Mr 的HA 在0.009～0.039 mg/mL 的浓度范围，对四种供试菌均无抑制性。HA对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和志贺氏菌的MIC 值依次为：0.312、1.25、2.5 和2.5 mg/mL，再结合不同浓度下菌种的生长情况可知对四种菌的抑菌情况为：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志贺氏菌，与抑菌圈测定结果一致。

由表6可知，HA在0.009～0.078 mg/mL的浓度范围，对四种供试菌均无抑制性，MIC 值依次为：1.25、2.5、2.5 和2.5 mg/mL。由表7可知，HA在0.009～0.156 mg/mL的浓度范围，对四种供试菌均无抑制性，MIC值依次为：2.5、2.5、2.5和5 mg/mL，这些数据都进一步说明随Mr 降低HA 的抑菌性呈下降趋势。同样与抑菌圈测定结果相符。

由表8可知，低Mr的HA在0.009～0.156 mg/mL的浓度范围内，对四种供试菌无抑制性，但浓度在0.312 mg/mL时其抑菌性低于中Mr的HA，其MIC值仅对大肠杆菌达到2.5 mg/mL，对其余三种菌株均为5 mg/mL，结合表4结果发现HA浓度为5 mg/mL时抑菌圈直径大小都为6 mm附近，说明虽然有抑菌效果，但抑菌效果很小，前后结果相符。

（三）透明质酸在干酪制品中的抑菌作用。经上述研究发现，高Mr的HA在10 mg/mL时抑菌作用最强，将其应用于原制干酪和再制干酪两款产品，测定样品存放期间菌落总数的变化，结果见表9和图2。

表9 不同干酪制品在存放期间菌落总数的变化

由图2可知，干酪制品在存放期间其菌落总数随时间延长呈上升趋势。相比于干酪制品对照组，试验组在添加HA后明显抑制了样品中菌落总数的生长。对照组样品在第7天菌落总数达到105 cfu/mL，而试验组的菌落总数为104 cfu/mL。对照组在前3天菌落总数增加较为缓慢，这是因为在干酪制品中本身存在食品防腐剂，其中原制干酪中添加了山梨酸钾和纳他霉素，再制干酪仅添加山梨酸钾，因为原制干酪营养较再制干酪更为丰富，所以更易变质。试验组中因为添加HA，使样品的菌落总数在第4天之后开始快速增长，延长了微生物生长的迟缓期，这与食品防腐剂作用相同。之后对照组和试验组中菌落总数均开始快速增长，是因为食品防腐剂仅能起到抑制微生物生长，延长迟缓期的作用，而当样品中微生物达到一定数量时，即使添加再多防腐剂也无用。在第6天之后，样品中的菌落总数增长速率有所下降，是因为食品中营养物质的下降，以及微生物间的竞争作用。

三、结语

本研究通过比较高Mr（1800-2200 kDa）、中Mr（1300-1500 kDa、800-1000 kDa）、低Mr（200-400 kDa）四种HA 在不同浓度（15 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL）时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和志贺氏菌的抑菌性能，发现不同Mr、不同浓度的HA 对四种供试菌均具有抑菌性，且抑菌性能随HA 的Mr 降低而呈下降趋势。高Mr 的HA 在中浓度（10 mg/mL）时抑菌性能最高，中Mr 和低Mr 的HA 在高浓度（15 mg/mL）时抑菌性能较高。HA 对四种供试菌的抑制程度依次为：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志贺氏菌。将HA应用于干酪制品，发现样品在存放期间菌落总数的增长得到明显抑制，具有食品防腐剂功效，该研究为HA的应用开发奠定了一定理论基础。