电针对应激性溃疡小鼠十二指肠黏膜内CD4、CD8、SIgA 及炎症因子表达的影响

陈 琳，邱渊铭，赵 洋，阳晶晶，曹思慧，何灏龙，杨宗保，常小荣，刘 琼*，刘 密*

1.湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南 长沙 410208；2.厦门大学医学院，福建 厦门 361102

应激性溃疡是临床常见胃肠疾病之一，其主要临床特征以胃和十二指肠黏膜的溃疡、糜烂为主，且病程后期病变部位多集中于十二指肠部[1]。 随着社会的快速发展，人们的压力日益增大，加上环境污染、饮食作息不规律等社会问题，使人们长期处于有害的应激状态之中，致使胃肠溃疡的患病率逐年攀升[2]。 目前，临床上多选用克拉霉素、甲硝唑、奥美拉唑、西咪替丁及盐酸度洛西汀等药物联合应用为主[3]，但药物的长期使用容易引发多种不良反应[4-5]。

针灸作为我国传统的外治疗法之一，被广泛应用于胃肠病的治疗中，与药物治疗相比具有绿色、便捷及毒副作用小等优势[6-9]。 既往研究表明，针刺可有效调节消化性溃疡大鼠胃肠组织的炎症因子水平，减轻肠道炎症，改善胃肠黏膜损伤，实现对胃肠疾病的治疗作用[10-13]。 有关研究证实，电针能显著提高机体免疫功能水平，通过提高免疫应答能力从而增强胃肠功能[14-15]。 但目前较少有关于针灸通过改善肠道炎症反应，调节肠道免疫功能，促进十二指肠黏膜损伤修复，从而治疗应激性溃疡的研究。 因此，本实验以此为切入点，建立应激性溃疡模型小鼠，并分别对“手三里”“足三里”进行电针干预，观察各组小鼠十二指肠黏膜组织形态学改变，以及炎性细胞因子白细胞介素-1β（interlenkin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、免疫功能相关分化抗原4（cluster of differentiation 4, CD4）、分化抗原8（cluster of differentiation 8, CD8）及分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A, SIgA）的表达水平，探讨电针对十二指肠黏膜损伤修复的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF 级雄性KM 小鼠40 只，体质量38～45 g，由厦门大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2018-0009。 小鼠分笼饲养于厦门大学实验动物中心实验室，昼夜交替周期为12 h，饲养温度24～26 ℃，相对湿度60%～70%。 适应性饲养1 周后，将40 只KM 小鼠完全随机分为空白组12只和造模组28 只，造模组建立应激性溃疡模型。 造模结束后在空白组和造模组中分别随机抽取4 只小鼠进行模型评价，确认模型制备成功后，将造模组剩余24 只小鼠二次随机分为3 组：模型组、手三里组及足三里组，每组8 只。 实验过程遵循国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导意见》，动物实验伦理号：XMULAC20190142。

1.2 主要试剂与仪器

4%多聚甲醛（上海沪试实验器材股份有限公司，批号：342004）；RNA 提取试剂盒（北京艾德莱生物技术有限公司，批号：RN03）；逆转录试剂盒（日本TOYOBO 公司，批号：FSQ-101）；Agarose（德国Biofrox公司，批号：1110GR100）；50×TAE（北京索莱宝科技有限公司，批号：T1060-500）；4SGreen Plus 无毒核酸染料（上海生物工程股份有限公司，批号：EA26BA0029）；2×HieffTMPCR（上海翊胜生物科技有限公司，批号：10102ES08）；Trans2K Maker（北京全式金生物技术有限公司，批号：BM101）；IL-1β Elisa 试剂盒、CD4 Elisa 试剂盒、CD8 Elisa 试剂盒、SIgA Elisa 试剂盒、TNF-α Elisa 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：H002、H156、H157、H108-2、H052）。

低温高速离心机、低速离心机（美国SCILOGBX公司，型号：D3024R、S1010E）；GloMax 酶标仪（美国Promega 公司，型号：GM3030）；振荡仪、摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：10RTEX-5、TSB-108）；电泳仪（美国BIO-RAD 公司，型号：041BR126545）；超微量分光光度计（美国NanoVue 公司，型号：NanoVue Plus）；荧光显微镜、组织包埋机、组织切片机（德国Leica 公司，型号：DM4B、EG1150、RM2235）；一次性无菌针灸针（北京汉医医疗器械有限公司，规格：0.17 mm×7 mm）；电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司，型号：SDZ-Ⅱ）；小鼠束缚器（哈尔滨市香坊区昕楚实验室用品有限公司，规格：110 mm×40 mm×30 mm）。

1.3 造模方法

本研究使用束缚-冷浸法制备应激性溃疡模型[16]。 造模前，将小鼠禁食不禁水24 h，然后用束缚器（110 mm×40 mm×30 mm）固定，将小鼠连同束缚器垂直立浸于41 ℃水箱中，水平面齐平胸骨剑突，1 h后取出小鼠，暖风吹干，之后恢复常规饲料喂养、饮水。造模结束后，在空白组和造模组中分别随机抽取4只小鼠进行模型评价：空白组小鼠镜下十二直肠黏膜固有层细胞排列规整，腺体排列整齐，未见炎性细胞浸润；造模组小鼠镜下可见十二指肠黏膜组织固有层变薄，组织深染，腺体排列不规整，组织内有广泛的炎性细胞浸润等反应，提示模型制备成功[17]。

1.4 治疗方法

穴位定位参考实验针灸学动物穴位定位法[18]。足三里：膝关节下方，腓骨小头下约0.3 cm 处的肌沟中；手三里：前臂背外侧上1/4 分点处的肌沟中。模型制备成功后，手三里组小鼠每日用束缚器固定并电针手三里穴1 次；足三里组小鼠每日用束缚器固定并电针足三里穴1 次；空白组及模型组仅用束缚器固定。所有干预每次30 min，每日1 次，连续7 d。

电针方法：使用汉医牌一次性无菌针灸针（0.17 mm×7 mm）分别在足三里、手三里直刺1 针，穴位旁开1 mm处，再直刺1 针辅助针，深度约5 mm，两针连接一对电针治疗仪电极。 采用疏密波（疏波时间5 s，密波时间10 s，疏波4 Hz，密波50 Hz，负载电压2～4 V；输出脉冲宽度0.5 ms），强度以毫针针体出现轻微颤动为度。

1.5 检测方法

1.5.1 HE 染色 将各组小鼠十二指肠组织置于4%多聚甲醛中固定，修块后放进包埋盒中；用流水将多聚甲醛完全冲洗后，乙醇脱水，过夜；石蜡包埋，切片展片（片厚5 μm）。 片子置于60 ℃烘箱2 h 后进行梯度脱蜡，并用PBS 清洗3 次；苏木精染色后冲洗片子，使用1%氨水返蓝；再使用1%伊红染色15 s 后冲洗，再次梯度脱水后使用中性树胶封片。分别在100、400 倍率下观察十二指肠黏膜结构以及腺体，并使用图像采集系统将病理图片进行采集。

1.5.2 ELISA 检测 将各组小鼠十二指肠组织匀浆，置于4 ℃、12 000 r/min、半径8 cm 离心20 min，取上清液备用；配制不同浓度的标准品，并取100 μL加入标准孔；取100 μL 待测样品加入其他孔，混匀后封板温育；弃去液体甩干后加生物素化抗体工作液，混匀封板温育；洗板，去液体，用洗涤液浸泡后吸去液体；甩干，洗板5 次；接着每孔加90 μL 底物溶液，封板温育，最后加终止液50 μL，终止反应；15 min 以内于450 nm 波长处测量各孔的吸光度（OD）值。 根据标准曲线，计算每个组织指标含量。

1.5.3 RT-PCR 检测 将各组小鼠十二指肠组织用两步法进行RT-PCR 检测。 首先设计引物（表1）；提取mRNA，组织液氮研磨后Trizol 裂解、离心（4 ℃，12 000 r/min，半径8 cm，10 min）；取上清液，加入0.2 mL 氯仿（每毫升裂解液），震荡、孵育、离心（4 ℃，12 000 r/min，半径8 cm，10 min）；取上清液，加上清水相体积一半的乙醇，混匀离心后转移到吸附柱；加去蛋白液后再离心（室温，12 000 r/min，半径8 cm，45 s），然后加漂洗液漂洗两次，离心（室温，12 000 r/min，半径8 cm，45 s）；加水洗脱RNA，酶标仪测RNA浓度；加Primer mix、RT Enzyme mix、5×RT buffer混匀孵育cDNA；接着cDNA 与Primer F、Primer R、2×HieffTMPCR、DEPC 水混匀；经qPCR 程序后琼脂糖凝胶电泳，成像计算各指标含量，RT-PCR图片采用ImageJ 软件进行灰度分析，数据结果与相应的内参进行对比，通过均一化处理进行数据标准化。

表1 RT-PCR 引物信息

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计量资料用“±s”表示。 数据符合正态分布和方差齐性，则使用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验；若不符合方差齐性，则用Dunnet T3 分析；若数据不符合正态分布，采用秩和检验。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况观察

空白组小鼠精神状态良好，反应灵敏，进食量、饮水量及二便正常，毛发光泽柔顺，体质量增加。 造模后，模型组、手三里组及足三里组小鼠精神状态欠佳，活动量减少，进食饮水量减少，大便稀软，毛发枯槁易脱落，体质量下降。 随着治疗进行，足三里组小鼠精神状态逐渐改善，进食饮水量、体质量稳定增加，毛发逐渐恢复光泽，大便成形；手三里组小鼠一般情况较模型组小鼠有所改善，但改变不及足三里组小鼠明显。

2.2 各组小鼠十二指肠黏膜组织形态学比较

HE 染色结果显示，空白组小鼠十二指肠黏膜组织固有层细胞排列整齐，腺体排列规则，未见明显炎性细胞浸润。 模型组小鼠十二指肠黏膜组织固有层明显变薄，排列不规则，组织深染，十二指肠腺体排列不规整，有广泛的炎性细胞浸润。手三里组与足三里组小鼠十二指肠黏膜组织固有层厚度增加，固有层细胞增加，排列整齐。 详见图1。

图1 各组小鼠十二指肠组织HE 染色观察结果

2.3 各组小鼠十二指肠黏膜免疫屏障相关蛋白含量比较

与空白组相比，模型组十二指肠黏膜组织内IL-1β、TNF-α、SIgA 蛋白含量明显升高（P＜0.01），CD4、CD8 蛋白含量明显下降（P＜0.01）。 与模型组相比，足三里组IL-1β、TNF-α、SIgA 蛋白含量下降（P＜0.05 或P＜0.01），CD4、CD8 蛋白含量升高（P＜0.05 或P＜0.01）；手三里组IL-1β、TNF-α 蛋白含量下降（P＜0.05），CD4、CD8、SIgA 蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）。 与手三里组相比，足三里组CD8 蛋白含量上升（P＜0.05），IL-1β、TNF-α、CD4 及SIgA 蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见图2。

图2 各组小鼠十二指肠黏膜CD4、CD8、SIgA、IL-1β、TNF-α 蛋白表达水平比较（±s，n=8）

2.4 各组小鼠十二指肠黏膜免疫屏障相关基因比较

与空白组相比，模型组IL-1β、TNF-α、SIgA 的mRNA 表达量显著升高（P＜0.01），CD4、CD8 的mRNA 表达量显著下降（P＜0.01）。 与模型组相比，足三里组IL-1β、TNF-α、SIgA 的mRNA 表达量下降（P＜0.05），CD4、CD8 的mRNA 表达量升高（P＜0.05）；手三里组IL-1β、TNF-α 的mRNA 表达量下降（P＜0.05），CD4、CD8、SIgA 的mRNA 差异无统计学意义（P＞0.05）。与手三里相比，足三里组CD8 mRNA 表达量上升（P＜0.05），SIgA mRNA 表达量下降（P＜0.05），IL-1β、TNF-α、CD4 的mRNA 差异无统计学意义（P＞0.05）。详见图3。

图3 各组小鼠十二指肠黏膜IL-1β、TNF-α、CD4、CD8、SIgA 基因表达水平比较（±s，n=8）

3 讨论

应激性溃疡是指机体在应激状态下发生的以炎症糜烂、浅表性溃疡及胃肠道出血为特征的急性胃肠黏膜病变，属于中医学“痞满”“胃痛”“嘈杂”等范畴，病位在脾胃[19]。脾胃居中焦，为后天之本，气血生化之源，乃气机升降之枢纽。 若脾胃素虚，或久病年老，脾胃衰败，运化失职，气机不畅，易致脘腹不通则痛；脾胃气血化生不足，易致脘腹不荣则痛。 《灵枢·本输》曰：“大肠属上，小肠属下，足阳明胃脉也，大肠小肠，皆属于胃，是足阳明也。 ”足三里为足阳明胃经的合穴，可健脾和胃、调和气血。现代研究表明，刺激足三里可增强迷走神经紧张性，进而提高胆碱能抗炎通路的活力，实现改善胃肠道炎症的作用[20]。手三里属手阳明大肠经，《针灸大全·席弘赋》中记载其主“肩上痛连脐不休，食癖气块”，更有十四经主治歌诀中提到“三里消胀穴在手，腹胀不仁瘫难走”，可见手三里为古代治疗腹痛、腹胀常用穴位。现代临床应用中发现，手三里具有镇痛、抗炎的作用[21-24]。 故本研究选用手三里穴作为对照组，以探究足三里穴治疗应激性溃疡是否具有特异性。

应激性溃疡的发生与胃肠黏膜损伤的因素增加及屏障的保护机制减弱有关[25]。研究表明，机体处于应激状态下可能出现胃肠黏膜的炎症和免疫反应的改变，产生大量炎性细胞浸润和各种细胞因子渗出，使促炎细胞因子与抗炎细胞因子失衡，导致胃肠黏膜损伤[26]。 TNF-α 作为细胞增殖和凋亡的主要促炎细胞因子，在炎性反应性肠病的发病机制中具有重要的调节作用[27-29]，可通过诱导内皮细胞进一步合成释放IL-1β 等[30]。 研究证明，IL-1β 的升高可对血管内皮功能造成损害，并促使自由基的合成诱发高凝状态，导致微循环血栓，影响溃疡的治疗与预后[31-32]。 本实验证实，应激性溃疡时，模型组小鼠十二指肠黏膜内IL-1β 及TNF-α 的表达水平较空白组小鼠升高，说明应激可诱发胃肠黏膜炎症，进而激活肠道内免疫反应。 与模型组相比，经电针干预后的足三里组及手三里组小鼠十二指肠黏膜组织中IL-1β、TNFα 促炎细胞因子表达水平下降，且两组IL-1β、TNFα 差异无统计学意义， 提示电针足三里和手三里可能通过降低IL-1β、TNF-α 的表达水平，从而减轻十二指肠炎症。

肠道内的促炎因子分泌增多可影响补体、杀伤细胞及吞噬细胞的活性，调节肠黏膜免疫屏障功能进而介导组织损伤过程。 肠黏膜免疫屏障主要由体液免疫和细胞免疫构成，二者共同诱导机体产生免疫应答，发挥肠道免疫调节作用[33]。 T 淋巴细胞亚群是构成细胞免疫的重要组成部分，CD4+T 细胞可以调控和辅助其他淋巴细胞发挥功能，CD8 蛋白是杀伤性T 细胞的主要表面标志物，CD8+T 细胞通过表面的Ⅰ类主要组织相容性复合物分子与CD4+等其他免疫细胞的Ⅱ类主要组织相容性复合物分子结合，从而识别其他免疫细胞表面结合的抗原物质，产生杀伤作用，以此对抗致病原[34]。SIgA 是肠道内体液免疫的重要参与者，是肠黏膜屏障的第一道屏障，其主要功能是阻断病原微生物对黏膜的吸附，抑制病原体或细菌增殖、中和毒素，从而达到保护肠道黏膜的作用[35]。有研究表明，CD4 蛋白表达水平降低可刺激B 细胞分泌活跃，从而使体液免疫亢进[36]。与其结果相似，在本研究中，模型组小鼠CD4、CD8 蛋白及mRNA 表达水平较空白组小鼠降低，SIgA 蛋白及mRNA 表达水平升高，提示在应激性溃疡发生时，肠道内免疫功能紊乱，使肠道黏膜更易受损。与模型组相比，足三里组小鼠CD4、CD8 蛋白及mRNA 表达升高，SIgA 蛋白及mRNA 表达水平显著下降，而手三里组CD4、CD8、SIgA 蛋白及mRNA 表达差异无统计学意义，表明电针足三里可通过调整细胞和体液免疫，促进十二指肠黏膜损伤修复。

综上所述，电针能够改善应激性溃疡小鼠十二指肠黏膜病理改变，有效调节十二指肠炎性因子水平，调整肠道内细胞和体液免疫，从而促进十二指肠黏膜损伤的修复，且足三里穴较手三里穴调节十二指肠黏膜免疫功能效果更佳。