牛膝总皂苷对IL-1β 诱导髓核细胞的凋亡及炎性损伤的影响

李硕夫，刘宏哲，张嘉麟，杨 雷，陈 龙，郭彦涛，刘笑蓉*

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省人民医院，湖南 长沙 410002；3.中南大学，湖南 长沙 410083；4.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

腰痛是临床上最为常见的症状之一[1]，流行病学显示，全球约有80%的人会在一生中经历一次腰痛[2]，其中24%～80%的人在一年内会再次发作[3]；而在我国， 腰痛已经成为45 岁以下人群丧失劳动能力的首要原因[4]。 椎间盘退行性变性（intervertebral disc degeneration, IDD）被认为是引起腰痛的主要原因[5-6]，其病变本质可能是免疫炎症反应及氧化应激损伤等引起的髓核细胞（nucleus pulposus cell,NPC）数量减少和功能下降，以及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）代谢的异常[7]。白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）及环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）等炎症因子被认为是引起IDD 和腰痛的关键介质，在IDD 中显著上调，并且参与NPC 凋亡以及ECM 的降解，是引起IDD 的重要原因之一[8-10]。因此，抑制炎症因子的表达，减少细胞凋亡和ECM 降解是改善IDD的主要方法。 此外，积极寻找抑制NPC 炎性损伤，减少NPC 凋亡的药物，对于延缓IDD 也至关重要。

IDD 属于中医学“痹病”“腰痛”范畴，中医病机主要是肝肾亏虚，腰府失养，瘀血阻络，治疗以补肾活血为主。牛膝具有补肾、健骨、强脊等功效，是临床上治疗腰痛病的常用中药之一，其有效成分牛膝总皂苷（achyranthes bidentata saponins, ABS）被证实具有抑制软骨细胞炎症反应[11]、促进软骨细胞增殖[12]、抑制软骨细胞凋亡[13]等作用，并可抑制COX-2 的产生[14]。NPC 被称为“类软骨细胞”，其与关节软骨细胞的结构和生存环境十分相似。 ABS 是否能抑制NPC的炎性损伤，减少凋亡，抑制ECM 降解，促进NPC数量及功能恢复等，还未见相关报道。 本实验以人源NPC 为研究对象，通过IL-1β 诱导建立NPC 退变模型，观察ABS 对NPC 的凋亡、炎症及ECM 代谢的影响，并初步探究ABS 对NPC 损伤的保护作用及机制，以期为延缓IDD 和临床应用ABS 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞

退行性NPC（批号：LY0104）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。

1.2 主要试剂

牛膝（批号：A220113）、胰酶消化液（批号：01A220418）、双抗青/链霉素（货号：SV30010）均购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清（批号：8122618，美国Grand Island Biological Company 公司）；细胞冻存液（批号：20220809）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）（批号：08A230615）、RIPA 裂解液（批号：04B230707）、蛋白磷酸酶抑制剂（批号：01B230713）、SuperECL Plus 超敏发光液（批号：06C230629）、10%过硫酸铵（ammonium persulfate, APS）（批号：02C230726）、10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate, SDS）（批号：01D230727）、四甲基乙二胺（批号：03D230615）均购自长沙艾碧维生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒（批号：PN659，日本同仁化学研究所）；凋亡试剂盒（批号：20220731，江苏凯基生物技术股份有限公司）；B 细胞淋巴瘤-2相 关X 蛋 白（B-cell lymphoma-2-associated X pro tein, Bax）抗体（批号：GR3275117-9）、B 细胞淋巴瘤-xl（B-cell lymphoma-xl, Bcl-xl）抗体（货号：ab32370）、血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5（recombinant a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-5, ADAMTS-5）抗体（批号：GR116650-1）、COX-2 抗体（货号：ab179800）、β-actin（货号：66009-1-Ig）均购自英国艾博抗（上海）贸易有限公司；天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-3）抗体（货号：19677-1-AP）、基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3, MMP-3）抗体（货号：17873-1-AP）、HRP 山羊抗小鼠IgG 抗体（货号：SA00001-1）、HRP山羊抗兔IgG 抗体（货号：SA00001-2）均购自美国Proteintech 公司。

1.3 主要仪器

超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司，型号：YT-CJ-2NB）；倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司，型号：DSZ2000X）；电泳仪、电泳槽、转膜仪（北京六一仪器厂，型号：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）；多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，型号：MB-530）；低速离心机（上海知信仪器公司，型号：SL02）。

1.4 实验方法

1.4.1 ABS 制取与定量测定 按照标准的川牛膝总皂苷提取流程提取ABS[15]：称取川牛膝100 g，放入圆底烧瓶（2 L），加入95%乙醇1 L，加热回流提取3 次，1 h/次，合并提取液，70 ℃水浴旋蒸浓缩至无醇味，剩余提取液加入纯水定容至1 L，超声10 min，抽滤后量取150 mL 抽滤液，经大孔吸附树脂柱，然后使用600 mL 的纯水将其中水溶性成分洗脱并丢弃，接着再用70%乙醇500 mL 继续洗脱，并收集此洗脱液干燥，直至重量不再变化。 以齐墩果酸对照品为参照，最后使用紫外可见分光光度法分析。

1.4.2 NPC 退变模型的建立及实验分组 将对数生长期的NPC，按照1×105个/孔接种于96 孔板中，IL-1β 和ABS 浓度参考相关文献[16-17]设定，设置5 个组，每组5 个复孔：正常组、模型组（10 ng/mL 的IL-1β）、ABS 低剂量组（10 ng/mL 的IL-1β+3 μg/mL ABS）、ABS 中剂量组（10 ng/mL 的IL-1β+10 μg/mL ABS）和ABS 高剂量组（10 ng/mL 的IL-1β+30 μg/mL ABS）。 按照分组建立细胞培养体系后，将各处理组细胞置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h，结束后收集细胞，进行后续实验研究。

1.4.3 Tunel 法及流式细胞术检测NPC 凋亡 （1）Tunel染色观察NPC 凋亡。 收集各组处理后的NPC，制作爬片，固定，按照Tunel 凋亡试剂盒说明书步骤操作。显微镜下计数凋亡细胞数及总细胞数，计算凋亡指数。（2）流式细胞术检测细胞凋亡。收集各组处理后的NPC，使用PBS 将收集到的细胞洗涤2 次，再2 000 r/min，离心5 min，离心半径为9 cm。 然后按照说明书，将500 μL 的结合缓冲液悬浮细胞加入试管，先加入5 μL Annexin V-APC 混匀，再加入5 μL 碘化丙锭溶液混匀，最后在室温、避光条件下使其充分反应10 min，并在1 h 内使用流式细胞仪观察、检测。

1.4.4 CCK-8 实验检测细胞活力 收集各组处理后的NPC，调整细胞浓度，按照5×105个细胞/孔密度接种于96 孔板内，每个孔加10 μL CCK-8 标准液，先使用完全培养基将CCK-8 配制浓度为10%的溶液，去除含药培养基后，再每孔加入100 μL 的上述配制含CCK-8 溶液的培养基。在37 ℃，5%CO2环境下孵育4 h，使用多功能酶标仪分析NPC 在450 nm 处的吸光度（optical density, OD）值，计算细胞存活率，对照组细胞相对存活率设定为100%，其余各组细胞相对存活率计算如下：存活率=（实验组OD 值-正常组OD 值）/正常组OD 值×100%。

1.4.5 Western blot 检 测Bax、Bcl-xl、Caspase-3、ADAMTS-5、MMP-3 及COX-2 蛋白表达情况 收集各组处理后的NPC，采用含有PMSF 的RIPA 裂解液提取细胞中的总蛋白，测量样品蛋白浓度后，上样电泳。 冰浴中给予250 mA 电流转膜。 洗涤PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭90 min 后，将PVDF 膜与稀释的一抗Bax（1∶2 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bclxl（1 ∶1 000）、ADAMTS-5（1 ∶250）、MMP-3（1 ∶1 000）、COX-2（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）在4 ℃过夜温育，TBST 洗涤3 次，每次10 min，加入二抗HRP 山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）或HRP 山羊抗兔IgG（1∶6 000），室温下孵育2 h。 膜上滴加ECL 发光显色液后，于化学发光成像系统下进行检测，使用Image Pro Plus 6.0 软件对蛋白条带进行灰度扫描，分析蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

使用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以“±s”表示，符合正态分布者采用方差分析，不符合正态分布的采用Wilcoxon 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ABS 对IL-1β 诱导的NPC 细胞活力的影响

与正常组比较，模型组NPC 细胞活力显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，ABS 低、中、高剂量组NPC 中细胞活力明显增加（P＜0.05）；与ABS 低剂量组比较，ABS 中、高剂量组细胞活力明显增加（P＜0.05）。 详见图1。

图1 不同浓度ABS 对NPC 活力的影响（n=5）

2.2 ABS 对IL-1β 诱导的NPC 阳性率及凋亡的影响

正常NPC 核呈蓝紫色，凋亡细胞核为绿色荧光。与正常组比较，模型组NPC 阳性率显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，ABS 低、中、高剂量组NPC 阳性率降低（P＜0.05）；与ABS 低剂量组比较，ABS 中、高剂量组NPC 阳性率明显降低（P＜0.05）。 详见图2。

图2 不同浓度ABS 对NPC 阳性率的影响（×200）（n=5）

与正常组比较，模型组细胞凋亡率增加（P＜0.01）；与模型组比较，ABS 低、中、高剂量组细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与ABS 低剂量组比较，ABS 中、高剂量组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。 详见图3。

图3 不同浓度ABS 对NPCs 凋亡率的影响（n=5）

2.3 ABS 对IL-1β 诱导的NPC 的ECM 代谢相关蛋白ADAMTS-5、MMP-3 表达的影响

与正常组相比，模型组NPC 中ADAMTS-5、MMP-3 蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与模型组相比，ABS 低、中、高剂量组NPC 中ADAMTS-5、MMP-3蛋白表达均显著降低（P＜0.05）；与ABS 低剂量组比较，ABS 中、高剂量组NPC 中ADAMTS-5、MMP-3蛋白表达降低（P＜0.05）。 详见图4。

图4 不同浓度ABS 对ADAMTS-5、MMP-3 蛋白表达的影响（n=5）

2.4 ABS 对IL-1β 诱导的NPC 凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xl 及Caspase-3 表达的影响

与正常组相比，模型组NPC 中Bax、Caspase-3蛋白表达显著上调（P＜0.05），Bcl-xl 蛋白表达显著下调（P＜0.05）；与模型组相比，ABS 低、中、高剂量组NPC中Bax、Caspase-3 蛋白表达均显著下调（P＜0.05），Bcl-xl 蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与ABS 低 剂 量组比较，ABS 中、高剂量组NPC 中Bax、Caspase-3 蛋白表达降低（P＜0.05），Bcl-xl 蛋白表达升高（P＜0.05）。 详见图5。

图5 不同浓度ABS 对Bax、Bcl-xl 及Caspase-3 蛋白表达影响（n=5）

2.5 ABS 对IL-1β 诱 导的NPC 炎症蛋白COX-2表达的影响

与正常组比较，模型组NPC 中COX-2 蛋白的表达显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，ABS 低、中、高剂量组NPC 中COX-2 蛋白的表达显著下降（P＜0.05）；与ABS 低剂量组比较，ABS 中、高剂量组NPC中COX-2 蛋白表达降低（P＜0.05）。 详见图6。

图6 ABS 对COX-2 蛋白表达影响（n=5）

3 讨论

腰痛属于复杂难治性疾病，中医学认为其病机主要是本虚标实，以肝肾亏虚为本，瘀血阻络为标，正如《医林绳墨·卷五》言：“故大抵腰痛之证，因于劳损而肾虚者甚多。 ”现代医学认为，腰痛与IDD 的关系密切，而IDD 的致病因素较多，与衰老、机械压力、炎症、肥胖、高血糖等因素均相关[18-19]。 椎间盘主要由ECM 和少量细胞构成，其中NPC 是主要细胞成分，也是合成ECM 的主要细胞。 IDD 表现为细胞数量下降以及ECM 合成不足、分解增多[20]。 现代研究表明，炎症反应是引起椎间盘内细胞数量下降和ECM代谢障碍的主要原因之一[5]，尤其以IL-1β、TNF-α、IL-6 等为代表的炎症因子增加[21-22]，不仅会刺激细胞，引发细胞凋亡，还会通过促进MMP-3、ADAMTS-5 等降解酶的增加引起ECM 中的蛋白聚糖、纤维蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白及胶原蛋白Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ等物质的降解，导致椎间盘结构和功能的改变，加速IDD的病理过程[23]。 此外，COX-2 也是触发炎症反应的关键环节，过量的炎症因子累积会引起COX-2 水平快速升高至正常水平的10～80 倍[24]，引起炎症部位前列腺素E2（prostaglandin-e-2, PGE2）、前列环素I2（prostaglandin-i-2, PGI2）和前列腺素E1（prostaglandin-e-1, PGE1）含量的增加，导致炎性损伤进一步加重，还会引发炎性疼痛[25]。 可见，减少炎症反应对椎间盘的损伤是延缓IDD 的重要途径。

细胞凋亡是受基因调控的程序性死亡，主要受Bcl-2 家族、Caspase 家族、癌基因、抑癌基因p53 等调控，其中Bax、Bcl-xl 及Caspase-3 等是最具有代表性的调控基因，Bax 属于促凋亡类，也是人体最主要的凋亡基因，被激活时能够形成寡聚体从细胞浆内转到线粒体膜上，与相应孔蛋白结合，改变线粒体膜的通透性，使蛋白水解酶以及细胞色素C（cytochrome C release, CytC）等激活，最后导致细胞凋亡[26]。通常情况下，当Bax 含量增多时，Bax/Bax 同源二聚体形成，使得细胞对死亡信号更敏感，启动凋亡过程[27]。Bcl-xl 属于抗凋亡蛋白，可以通过与Bax 结合形成Bax/Bcl-xl 二聚体，阻止Bax/Bax 二聚体形成，从而竞争性抑制细胞凋亡[28]。Caspase-3 则是凋亡过程中关键的执行酶，在细胞中通常以酶原的形式存在，在被激活后，被切割成小分子片段，降解各种蛋白，其凋亡的作用可被Bcl-xl 阻断[29]。

目前常用于治疗IDD 引起的腰痛的经典方法是手术切除椎间盘以减轻疼痛[30]。 但手术并不能修复或减缓潜在的退行性病变，同时还存在加重临椎IDD 的风险。相比于纯粹地机械性切除椎间盘，中医药具有多靶点、多途径、多效应的特点，具有恢复退变椎间盘生物功能、缓解病变、降低并发症等优点，已在防治腰痛及IDD 中发挥作用[31]。 牛膝是临床上防治腰痛的常用药物，中医学认为其具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行的功效。 ABS 是牛膝的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[32]，但其在IDD 中的研究相对较少，因此，深入研究ABS 对IDD 的治疗作用对于防治腰痛意义重大。

本研究结果显示，IL-1β 处理后的NPC，细胞凋亡及细胞阳性率显著增加，细胞活性降低，说明IL-1β 诱导可以引起NPC 炎性损伤，降低细胞活力，促进细胞凋亡。而使用不同浓度的ABS 进行干预后，NPC 的凋亡率显著下降，细胞活力显著上升，细胞凋亡率下降，说明ABS 能够对IL-1β 诱导的NPC产生保护作用，增强NPC 细胞活力，抑制NPC 细胞凋亡率。 在进一步探究其治疗机制过程中发现，IL-1β 诱导NPC 的Bcl-xl 蛋白的表达显著降低，Bax、Caspase-3、ADAMTS-5、MMP-3 及COX-2 蛋白的表达明显增加，说明IL-1β 诱导引起的炎性损伤过程中伴随着ADAMTS-5、MMP-3 等降解酶增加引起的ECM 降解，以及促凋亡因子Bax、Caspase-3 等的上升，抗凋亡因子Bcl-xl 的减少，而使用不同浓度的ABS 进行干预后，Bax、Caspase-3、ADAMTS-5、MMP-3 及COX-2 水平显著下降，Bcl-xl 显著上升，也说明ABS 可以通过抑制炎症反应、ECM 降解和细胞凋亡对NPC 产生保护作用。

综上所述，ABS 可以通过抑制由IL-1β 诱导引起的人源NPC 凋亡、炎性损伤、ECM 降解，增强细胞活性，对NPC 损伤产生保护作用，其机制可能与抑制Bax、Caspase-3、ADAMTS-5、MMP-3 及COX-2上升，促进Bcl-xl 表达有关。