基于指纹图谱及色度分析的不同基原枳实质量差异性研究

刘金金，刘艳梅 ，邓亚利 ，陈向东 ，罗文汇 ，孙冬梅

1.华南农业大学材料与能源学院，广东 广州 510642；2.广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

枳实始载于《神农本草经》，2020年版《中华人民共和国药典》规定其为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果[1]。枳实药材资源丰富，分布广泛，目前在我国长江流域及南方各省柑橘栽培地区资源最为丰富，主产于江西、四川、湖南等地[2]。枳实味苦、辛、酸，性微寒，入胃、脾经，具有破气散痞、泻痰消积功效，主治大便秘结、泻痢后重、积滞内停、痞满胀痛、结胸等症[3]。现有针对枳实的质量评价基本集中在不同药用部位[4]、不同产地[5]、不同炮制方法[6]等定性定量研究，对不同基原的鉴定和质量差异性研究鲜有报道。因此，本研究针对2种基原枳实建立多元质量控制体系，结合聚类分析、主成分分析、偏最小二乘回归分析法等化学模式识别技术及色度学原理[7]，对31批不同产地、不同基原的枳实药材进行质量差异性研究，为枳实药材质量标准完善及资源开发提供依据。

1 仪器与试药

Waters H-Class型超高效液相色谱（UPLC）仪；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），安捷伦有限公司；KQ-500DE型超纯水净化系统，Millipore公司；TS7700型分光测色仪，深圳汉三恩时科技有限公司；ME204E万分之一天平、XP26百万分之一天平，梅特勒-托利多公司；Milli-Q Direct超纯水系统，默克股份有限公司。

柚皮苷（批号110722-201714，纯度≥93.5%）、新橙皮苷（批号111857-201804，纯度≥99.4%）、橙皮苷（批号110721-201818，纯度≥96.2%）、橘皮素（批号112054-202102，纯度≥98.6%）对照品，中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷（批号wkp19041908）、水合橙皮内酯（批号wkp20031904）、川陈皮素（批号wkp20031701）、柚皮素（批号DST200109-100）、异橙皮内酯（批号ST83710105）、异橙黄酮（批号ST20600105）、野漆树苷（批号111919-201804）对照品，纯度≥98.0%，四川省维克奇生物科技有限公司。酸橙对照药材（批号120936-201606），中国食品药品检定研究院；甜橙对照药材（批号430033-202003），广州朗欧。乙腈、甲酸，德国Merck公司，色谱纯；甲醇，西陇科学股份有限公司，分析纯。

2种基原枳实药材共31批，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，分别为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果。样品来源信息见表1。

表1 枳实样品来源信息

2 方法与结果

2.1 指纹图谱及多指标含量测定方法建立

2.1.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；以乙腈为流动相A，0.2%甲酸水为流动相B，梯度洗脱（0～3 min，10%～15%A；3～6 min，15%～16%A；6～12 min，16%～18%A；12～16 min，18%A；16～18 min，18%～21%A；18～25 min，21%～24%A；25～30 min，24%～40%A；30～45 min，40%～100%A）；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；检测波长330 nm；进样量1 μL。

2.1.2 对照品溶液制备

精密称取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、异橙皮内酯、橘皮素、野漆树苷、芸香柚皮苷对照品适量，加甲醇制成含柚皮苷1073.940 μg/mL、新橙皮苷1071.930 μg/mL、橙皮苷400.451 μg/mL、川陈皮素50.078 μg/mL、柚皮素58.310 μg/mL、水合橙皮内酯62.731 μg/mL、异橙黄酮81.340 μg/mL、异橙皮内酯23.912 μg/mL、橘皮素44.067 μg/mL、野漆树苷37.016 μg/mL、芸香柚皮苷25.284 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备

取枳实粉末（过4号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定质量，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验

取同一份供试品溶液（SC1），按“2.1.1”项下色谱条件进样测定6次，以7号峰橙皮苷为参照峰，测得各成分色谱峰相对保留时间RSD为0.15%～1.90%，相对峰面积RSD为0.07%～2.14%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 重复性试验

取SC1样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，以7号峰橙皮苷为参照峰，测得24个共有峰的相对保留时间RSD为0.25%～1.00%，相对峰面积RSD为0.50%～1.70%，均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.3 稳定性考察

取同一份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、3、6、9、12、15、18、24 h进样，以7号峰橙皮苷为参照峰，各共有峰的相对保留时间RSD为0.18%～0.90%，相对峰面积RSD为0.39%～2.78%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 指纹图谱建立

取21批酸橙样品及10批甜橙样品，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，将所得数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），分别以酸橙对照药材（SC0）、甜橙对照药材（TC0）为参照物，时间窗宽度设为0.2 min，采用中位数法，进行多点校正与全谱峰匹配，分别生成酸橙和甜橙指纹图谱（见图1、图2）。最终确定酸橙共有峰24个，指认出其中11个；甜橙共有峰11个，指认出其中6个。见图3。以2种基原枳实对照药材作为参照图谱进行相应相似度计算，结果见表2。21批酸橙与对照药材的相似度为0.935～0.999，10批甜橙与对照药材相似度为0.937～0.998，均大于0.90，表明同一基原的枳实质量相对稳定，同一产地样品间的化学成分差异较小。

图1 21批酸橙样品指纹图谱叠加图

图2 10批甜橙样品指纹图谱叠加图

图3 酸橙和甜橙对照药材及有效成UPLC图

表2 31批枳实样品指纹图谱相似度评价

由酸橙和甜橙对照药材色谱图可知，不同基原枳实样品的指纹图谱共有峰信息和相似度存在显著差异，表明枳实同属药材之间的化学成分存在差异；酸橙整体色谱峰信息相对较多，响应值偏高，与甜橙对照图谱比较分析，峰1、峰2、峰3、野漆树苷、新橙皮苷、峰9、峰10、水合橙皮内酯、柚皮素、异橙黄酮、峰21、峰22、峰23及峰24为酸橙特有成分，表明建立的指纹图谱可实现2种法定基原枳实的有效区分。

2.1.6 聚类分析

将21批酸橙和10批甜橙的共有峰峰面积导入SPSS20.0软件，以组间联接聚类法结合欧式平方距离（d）进行系统聚类分析，结果见图4。当d=25时，31批枳实可聚为2类，一类为甜橙样品（TC1～TC10），另一类为酸橙样品（SC1～SC21），表明不同基原枳实可通过聚类分析进行有效区分；当d=5时，同一基原的枳实未能通过产地进行区分，表明同种枳实不同产地之间化学成分无明显差异。

图4 31批枳实样品聚类分析树状图

2.1.7 主成分分析

应用SPSS20.0统计软件，以31批枳实指纹图谱的共有峰为变量、以特征值＞1为筛选条件进行主成分分析（PCA），结果见表3。共得到3个主成分因子，其特征值分别为15.455、3.242、2.203，累计方差贡献率达87.080%，表明模型能较好地进行预测，提取的3个主成分因子可以代表指纹图谱中24个共有峰的信息，代表枳实不同基原的整体质量特征（见图5）。PCA可将2种基原枳实明显区分为2类，样本点之间无交叉点，且甜橙样品较为集中，表明同一产地的甜橙质量较为一致，酸橙组内离散程度较大，其中SC12、SC13、SC14与其他样品差异较大，表明酸橙样品存在产地质量差异。

图5 31批枳实样品PCA得分图

表3 枳实样品PCA特征值及方差贡献率

2.1.8 偏最小二乘判别分析

为更好识别不同基原枳实的差异性，在PCA基础上，利用SIMCA14.1软件进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），PLS-DA得分图见图6。31批枳实可按基原分为2类，与PCA、聚类分析结果一致；且模型数据矩阵的解释率参数R2X=0.738，区分参数R2Y=0.974，预测参数Q2=0.967，表明该模型具有良好的预测能力，稳定且可靠。在此基础上，为进一步研究影响2种基原枳实的差异性物质，利用变量重要性投影（VIP）进行分析，结果见图7。VIP值越大，表明该变量对模型的影响越大。以VIP＞1为标准，共筛选出11个对辨别酸橙和甜橙有较大影响的共有峰（VIP）：峰3（1.192 25）、野漆树苷（1.18078）、峰13（1.17157）、川陈皮素（1.16916）、水合橙皮内酯（1.15732）、新橙皮苷（1.12345）、峰23（1.12089）、峰12（1.07205）、峰24（1.05281）、峰20（1.05546）、柚皮苷（1.00520），可作为酸橙和甜橙基原鉴别的潜在质量标志物，用于评价枳实的质量差异。

图6 31批枳实样品PLS-DA得分图

图7 31批枳实样品指纹图谱共有峰VIP图

2.1.9 含量测定

2.1.9.1 线性关系考察

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液，分别稀释成不同浓度的混合对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进行检测，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归，结果见表4。相关系数（r）＞0.9990，表明各成分在相应定量范围内线性关系良好。

表4 11种成分线性关系考察结果

2.1.9.2 精密度考察

取“2.1.2”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，结果显示柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、异橙皮内酯、橘皮素、野漆树苷、芸香柚皮苷11个成分峰面积RSD分别为0.27%、0.40%、0.37%、1.83%、0.13%、0.95%、0.43%、1.87%、0.30%、0.53%、0.78%，表明仪器精密度良好。

2.1.9.3 重复性试验

精密称取6份枳实药材粉末（SC1），按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件检测，结果柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、异橙皮内酯、橘皮素、野漆树苷、芸香柚皮苷11个成分峰面积RSD分别为0.90%、0.39%、0.25%、0.48%、0.45%、0.96%、0.77%、1.67%、0.48%、0.91%、0.87%，表明该方法重复性较好。

2.1.9.4 稳定性试验

取“2.1.3”项下1份供试品溶液，分别于制备后0、3、6、9、12、15、18、24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进行检测，结果柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、异橙皮内酯、橘皮素、野漆树苷、芸香柚皮苷11个成分峰面积RSD分别为0.65%、0.57%、0.63%、0.66%、0.73%、0.75%、0.89%、0.89%、0.90%、1.23%、0.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.1.9.5 加样回收率试验

精密称取已知成分含量的枳实药材粉末（SC1）9份，每份0.25 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再分别加入与所取供试品中待测成分量比例为1.5∶1、1∶1、0.5∶1的对照品，按“2.1.1”项下色谱条件进行检测，并计算回收率。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、异橙皮内酯、橘皮素、野漆树苷、芸香柚皮苷的回收率分别为98%、97%、95%、101%、102%、99%、98%、90%、98%、101%、95%，表明该方法准确性良好。

2.1.9.6 样品测定

按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件检测，31批枳实药材中11个指标成分的含量测定结果见表5。柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、异橙皮内酯、橘皮素、芸香柚皮苷为酸橙和甜橙共有成分，其中21批酸橙上述6种成分平均质量分数为6.039%、1.108%、0.153%、0.051%、0.128%、0.844%，10批甜橙平均质量分数分别为0.009%、7.577%、0.121%、0.078%、0.055%、1.134%；酸橙中的特有成分新橙皮苷、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、野漆树苷平均质量分数为11.454%、0.156%、0.226%、0.129%、0.081%。通过含量测定结果箱线图（见图8），能直观区分酸橙和甜橙中代表性成分，酸橙中柚皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、橘皮素、野漆树苷含量整体高于甜橙，甜橙中橙皮苷、异橙皮内酯、芸香柚皮苷含量显著高于酸橙。不同产地酸橙枳实黄酮类成分离散程度较大，甜橙指标成分含量相对集中，无产地差异性。酸橙和甜橙黄酮类成分差异显著，推测可能与枳实瓤囊面积占比有关，酸橙的瓤囊面积占比较小，即中果皮相对较厚。石敬依等[8]对比研究不同产地枳实肉和瓤指纹图谱和6个黄酮类成分差异性，枳实肉标定17个共有峰，枳实瓤中标定10个共有峰，推测枳实中黄酮类成分主要存在于中果皮中。即酸橙枳实的总黄酮含量高与其果皮比甜橙较厚有一定相关性。

图8 酸橙与甜橙样品中11种成分含量测定箱线图

表5 31批枳实样品中11个成分含量测定结果（%）

2.2 不同基原枳实与色度值相关性分析

中药色度分析借助色度仪将药材的颜色转换成具体数值进行药材颜色和质量之间相关性的研究，通过药材的色度值评价药材质量[9]。2020年版《中华人民共和国药典》规定枳实性状为黄白色或黄褐色，颜色跨度较大。观察多批次枳实粉末发现，酸橙与甜橙颜色差异明显[10]。其颜色变化可能与主要黄酮类成分具有一定相关性。为进一步验证上述观点，本研究基于色度学原理将枳实药材的外在颜色进行色度值量化，结合含量测定和统计学分析工具评价其质量差异性。

2.2.1 色度测量方法建立

2.2.1.1 供试品制备

取31批枳实药材，粉碎，过4号筛，即得。

2.2.1.2 分光测色仪参数

采用国际照明委员会（CIE）认可光源，以反射光为测色模式，采用L*、a*、b*色空间，其中L*值代表明度，可用于药材色泽判断；a*值代表红（+）绿（-）方向；b*值代表黄（+）蓝（-）方向，观察光源为D65（即色温度6504K的自然日光），视野角度为10°，以4 mm为视角测定口径。

2.2.1.3 方法学考察

按上述分光测色仪参数条件，取枳实药材供试品（编号SC1）进行连续6次的色度测定，记录L*、a*、b*值，并计算相应的总色度值（E*ab），RSD分别为0.96%、0.88%、1.02%、1.13%，均小于3%，表明仪器精密度较好。

2.2.1.4 供试品色度测定

将分光测色仪进行黑白校正后，分别对31批枳实供试品进行色度测定，每批各测定3次，记录L*、a*、b*值，计算E*ab，E*ab=（a*2+b*2+L*2）1/2，取平均值，结果见表6。酸橙E*ab为51.48～68.63，甜橙E*ab为73.33～77.85，酸橙总色度值低于甜橙。

表6 31批枳实药材色度测定结果

2.2.2 样品色度值与有效成分含量相关性

将31批枳实药材色度值测定及11个成分含量测定结果导入SPSS20.0统计软件，进行相关性分析，结果见表7。E*ab与橙皮苷和异橙皮内酯含量呈显著正相关，与柚皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、橘皮素和野漆树苷含量均呈显著负相关；L*与橙皮苷的含量呈正相关，与柚皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、柚皮素、水合橙皮内酯、异橙黄酮、橘皮素、野漆树苷含量呈负相关；a*与柚皮苷、新橙皮苷、异橙黄酮、野漆树苷含量呈显著正相关，随橙皮苷、异橙皮内酯含量的升高而降低；b*与柚皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、异橙黄酮、橘皮素及野漆树苷的含量呈正相关，随橙皮苷含量增加而降低。综合考虑，认为柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、异橙黄酮和野漆树苷的含量可能是导致酸橙和甜橙药材外在颜色差异性的主要成分。

表7 枳实药材色度值与有效成分含量相关性（r）

3 讨论

本试验共收集31批来自道地产区江西宜春、江西九江、江西吉安及湖南益阳的2种基原枳实，由于广东产区枳实年产量较少，批次较少，质量不及道地产区江西、湖南两地，故未纳入[11]。采用UPLC对21批酸橙和10批甜橙建立了指纹图谱，其中酸橙确认了24个共有峰，指认其中11个成分，甜橙确认了11个共有峰，指认其中6个成分。21批酸橙样品的指纹图谱相似度均在0.935以上，10批甜橙样品的指纹图谱相似度均大于0.937，表明21批酸橙和10批甜橙的整体质量相对稳定。同时运用化学模式识别方法聚类分析、PCA及PLS-DA对31批枳实的指纹图谱进行分析，结果显示，3种分析方法均可将不同基原枳实明显区分为2类，其中野漆树苷、川陈皮素、水合橙皮内酯、橙皮苷、新橙皮苷、异橙黄酮、柚皮苷及峰3、峰12、峰13、峰9、峰20、峰23、峰24所代表的成分可能是影响不同基原枳实质量差异性的标志性成分；结合聚类分析、PCA及PLS-DA结果，筛选出11个已指认的指标成分进行定量分析，结果显示，酸橙中含量最高的成分为柚皮苷和新橙皮苷，柚皮苷质量分数为4.080%～8.401%，新橙皮苷质量分数为4.901%～15.109%，甜橙中的成分则以芸香柚皮苷、橙皮苷为主，芸香柚皮苷质量分数为0.888%～1.629%，橙皮苷质量分数为5.242%～10.237%，表明本研究筛选出的中药特征性标志物方法比较全面、科学。2020年版《中华人民共和国药典》规定枳实的定量指标为辛弗林，本实验室对收集的31批枳实辛弗林含量进行测定，酸橙和甜橙中辛弗林含量无显著区别，且不是含量最高的成分，指标成分单一，从全面质量控制角度考虑，建议将柚皮苷、新橙皮苷引入酸橙质量控制指标，芸香柚皮苷和橙皮苷纳入甜橙质量控制标准。

为进一步区分枳实的不同基原，探究枳实的质量指标与其色度值之间的相关性，本研究对31批枳实药材粉末进行色度值测定与分析。结果表明，酸橙E*ab为51.48～68.63，甜橙E*ab为73.33～77.85，酸橙E*ab明显低于甜橙。由此表明，不同基原的枳实存在色度值差异，可能是由酸橙与甜橙药材中柚皮苷、新橙皮苷及橙皮苷等主要黄酮类成分含量差异导致的。

综上，本研究从定性和定量两方面分别对2种基原枳实进行研究，所建立的指纹图谱和含量测定方法简单快速、方便稳定、重复性好，与化学模式识别分析相结合，可用于酸橙和甜橙药材不同基原和不同产地间的质量评价，橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、异橙黄酮、野漆树苷等11个成分可能是造成二者质量差异的主要成分。将色度分析与统计学分析相结合，可作为快速鉴别酸橙和甜橙的新方法，为枳实不同基原间的鉴别和质量评价提供参考。