吲哚结构的荧光探针在粘度检测及细胞成像中的应用

余 强，李 祥，马素芳

（1．山西医科大学 医学影像学院，山西 太原 030001；2．山西医科大学 基础医学院，山西 太原 030001）

粘度作为细胞微环境的重要参数之一，不仅对细胞内信号转导和新陈代谢具有重要意义，而且能够通过影响活细胞内生物分子和化学信号的相互作用直接或间接影响细胞的各种生理功能，如自噬等［1-5］。此外，细胞内粘度的异常与许多疾病相关，如神经退行性疾病［6］、糖尿病［7］、癌症［8］等，因此，检测细胞内粘度的变化不仅对细胞生物学基础研究具有重要意义，而且对相关疾病的诊断和治疗具有非常重要的指导作用。

传统的粘度检测方法有毛细管、落球和旋转粘度计法等，然而以上方法仅适用于宏观流体粘度的检测，且因检测误差大、取样量多、会破坏生物样品等缺陷，无法用于细胞微环境内粘度的检测［9-11］。因此，亟需开发一种能够检测细胞微环境中粘度的新技术。荧光探针法是近年来兴起的一种新型检测技术，该方法具有操作简便、灵敏度高、可实时检测、非侵入式等优点，被广泛应用于活性小分子的检测［12-14］。近年来，荧光探针法与生物成像技术相结合，广泛应用于细胞内生物标志物的实时检测，大大加速了学者们对生物体内相关疾病发生和发展过程的了解，为疾病的精准诊断和治疗开辟了新方法［15-17］。其中，用于粘度检测的荧光探针也被相继开发［18-20］。然而，荧光成像技术用于细胞微环境粘度检测时，荧光探针常受到细胞微环境中pH值、极性以及细胞内活性物质的干扰。因此，构建一种特异性强、稳定性好的粘度探针是当前需解决的难点之一。此外，目前已报道的绝大多数粘度探针合成过程复杂，探针的纯化常需经过柱层析，甚至重结晶等方法，提高了探针制备成本。通过一步合成法构建特异性粘度探针，并减少其纯化过程是当前探针领域需解决的关键科学问题之一。2022年，董川课题组报道了一种线粒体靶向的近红外荧光探针，并实现了脂肪肝组织、炎症小鼠等模型中粘度的实时、原位和可视化检测［21］。

粘度响应的荧光探针的作用机制主要有以下几种：（1）分子内电荷转移（ICT）机理。该类探针一般具有D（电子供体）-π-A（电子受体）的结构特点。当探针分子识别粘度后，分子体系的推拉电子能力发生改变，导致其最佳吸收光谱和最佳荧光发射光谱发生变化，进而可通过光谱改变判断探针分子对粘度的识别能力。如林伟英课题组构建了一类基于ICT 机理的阳离子粘度探针，该探针可用于活细胞和斑马鱼线粒体中粘度的可视化检测［22］。（2）荧光共振能量转移（FRET）机理。基于FRET 识别机理的粘度探针，其最大的结构特点是供体的最佳发射波长和受体的最佳吸收波长具有一定的重叠，导致体系发生非辐射能量跃迁，进而实现对粘度的检测。如林伟英课题组报道的基于FRET 识别机理的比率型荧光探针，成功应用于线粒体中粘度的定量检测［23］。（3）扭曲分子内电荷转移（TICT）机理。大多数粘度探针基于该机理构建，此类探针一般具有可旋转的D-π-A结构，高粘度环境将限制分子结构中碳碳键的自由旋转，从而增大分子结构的共轭程度，导致其荧光增强。如唐波课题组报道的花菁类粘度探针，可通过TICT机理有效识别粘度，并成功应用于活体小鼠血栓中粘度的检测［24］。

基于TICT 机理构建的荧光探针，通常具备可旋转的D-π-A 结构，且对粘度介质具有较好的响应性。本文以吲哚作为电子供体，半花菁作为电子受体，通过Knoevenagel缩合反应制备了一种具有D-π-A结构的荧光探针1，并用于细胞中粘度的检测，系统研究了探针荧光强度随细胞粘度的变化。结果表明，随着体系粘度的增加，探针的荧光强度逐渐增强。此外，该探针对粘度具有较好的特异性，能够通过生物荧光成像实现对细胞中粘度变化的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Cary Eclipse 型荧光光谱仪（美国Varian 技术有限公司）；Bruker AVANCE Ⅲ 400 MHz 核磁共振仪（德国Bruker公司）；6210型质谱仪（安捷伦科技公司）；SGW® X-4显微熔点仪（上海仪电物理光学有限公司）；FV3000激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。

用于合成的原料化合物均购自安徽泽升科技有限公司；生物试剂鱼藤酮和羰基氰化氯苯腙（CCCP）购自上海迈瑞尔生化科技有限公司；人宫颈癌细胞（HeLa cells）购自中国科学院细胞库。

1.2 探针的制备

探针1的合成路线如图1所示。

图1 探针1的合成路线Fig．1 Synthetic route of probe 1

将1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物（1．0 g，2．8 mmol）和3-甲酰基吲哚（0．7 g，3．9 mmol）溶于乙醇中，回流反应5 h。浓缩反应液并抽滤，所得固体用无水乙醇重结晶，得到的荧光探针1 为橙色固体（0．5 g，收率33%）。

1.3 细胞毒性实验

将HeLa 细胞接种于96 孔板中后，在37 ℃、5% CO2的环境中孵育24 h 待其贴壁。弃去原有培养液，分别向实验组加入浓度为2、4、6、8、10、15、20、25、30 μmol/L的探针溶液100 μL，继续孵育24 h。将含有探针的培养液弃去，向每孔中加入3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液（0．5 mg/mL）100 μL，培养4 h后，再将二甲基亚砜（DMSO，100 μL）分别加入到实验组和对照组中，置于摇床上振荡15 min后，用酶标仪测定每孔于490 nm处的吸光度值。

1.4 细胞荧光成像实验

将HeLa细胞接种于培养皿中，置于培养箱中孵育24 h待其贴壁后分为3组。第1组细胞中加探针溶液（20 μmol/L，1 mL）培养30 min；第2组细胞中先加CCCP 溶液（10 μmol/L，1 mL）培养10 h后，再加探针溶液（20 μmol/L，1 mL）继续培养30 min；第3组细胞中先加鱼藤酮溶液（10 μmol/L，1 mL）培养8 h后，再加探针溶液（20 μmol/L，1 mL）继续培养30 min。培养完成后将3组细胞中的溶液分别弃去，加入磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤3 次，4%多聚甲醛固定15 min，重新加入PBS，在激光共聚焦显微镜下进行细胞荧光成像实验。

2 结果与讨论

2.1 探针分子结构表征

探针分子采用核磁氢谱（1H NMR）、核磁碳谱（13C NMR）、质谱（ESI-MS）和红外光谱（IR）进行表征，并进行熔点测定。结果如下：1H NMR（400 MHz，DMSO-D6）：δ8．71（s，1H），8．67（s，1H），8．29-8．26（m，1H），7．81-7．75（q，J=8．0 Hz，2H），7．63-7．61（m，1H），7．59（t，J=8．0 Hz，1H），7．51（t，J=8．0 Hz，1H），7．40-7．38（m，2H），7．21（d，J=16．0 Hz，1H），4．01（s，3H），1．81（s，6H）；13C NMR（100 MHz，DMSO-D6）：δ180．67，149．34，142．92，142．55，138．84，128．01，124．91，123．6，123．15，114．06，113．97，106．58，51．35，33．52，26．87；IR（cm-1）：3 427，3 118，1 577，1 480，1 405，1 239，820，751；EST-MS（m/z）：C21H22IN2计算值：429．082 8，实测值：429．084 0［M+H］+；熔点为276～277 ℃。

1H NMR 中，1．81 nm处为吲哚盐部分C3原子所连2个—CH3的H，4．01 nm处为吲哚盐部分N原子所连—CH3的H，7．21 nm 处为π 桥碳碳双键的H；IR 结果显示，3 427、3 118 cm-1处为N—H 键的伸缩振动峰，1 577、1 480 cm-1处为苯环碳碳骨架的振动峰，820 cm-1处为π 桥中碳碳双键所在碳的碳氢振动峰，751 cm-1处为苯环上的四氢峰。ESI-MS 也准确测定出化合物的相对分子量。

以上表征数据均证明探针分子成功制备。

2.2 探针的光学性能研究

2.2.1 荧光探针的粘度响应性研究为了考察探针对粘度的响应性能，分别测定了探针在不同比例（g∶g）的水-甘油体系中的荧光发射强度。如图2A 所示，随着体系粘度的逐渐增加，探针（λem= 517 nm）的荧光强度逐渐增强。与纯水体系相比，90%甘油体系的荧光强度增强了约100 倍，可能原因是，高粘度环境下，探针受体吲哚鎓盐和供体吲哚环之间C—C单键的自由旋转受限，使得整个分子能够共平面，导致其荧光增强。此外，根据Föster-Hoffmann 方程可知［25］，探针荧光强度的对数与体系粘度的对数具有较好的线性拟合关系（r2= 0．998 0，图2B），且检出限（3σ/k）为1．167 cP。以上结果表明所合成的探针对于粘度检测具有较高的灵敏度，有望用于微环境中粘度的检测。

图2 不同比例H2O-甘油体系中探针1的荧光发射光谱（A）及探针1荧光强度对数与体系粘度对数的线性关系（B）Fig．2 Fluorescence emission spectra of probe 1 in different ratios mixture of water-glycero（lA）and linear relationship between lgI and lgη（B）cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.2.2 荧光探针的选择性为了考察探针对粘度的选择性，在探针水溶液中分别加入不同的活性小分子、离子等，并测定体系的荧光强度，结果如图3A 所示：当探针水溶液中加入其它小分子或离子后，体系的荧光强度未发生明显改变，仅在甘油溶液中的荧光强度明显增强。此外，通过测定探针在不同溶剂体系中的荧光强度，发现其仅在甘油体系中的荧光明显增强，而在其它溶剂中的荧光强度均无明显变化（图3B）。由此可见，探针受其它物质或周围环境的影响较小，对粘度具有较好的选择性，具有检测细胞微环境中粘度变化的潜质。

图3 探针1在不同干扰物（A）及不同溶剂（B）中的荧光光谱Fig．3 Fluorescence spectra of probe 1 in the presence of various analytes（A） and in different solvents（B）cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.2.3 荧光探针的稳定性由于细胞内环境组成复杂，一种性能优良的粘度响应荧光探针还应具备良好的光稳定性和pH 值稳定性。为考察探针的光稳定性和pH 稳定性，分别测定了室温光照下探针水溶液及探针的90%甘油-水溶液在不同时间的荧光强度，结果如图4A 所示。由图可知，两种体系中探针的荧光强度在60 min 内均未发生明显改变。此外，对探针水溶液及探针的80%甘油-水溶液在不同pH 值下的荧光强度进行检测，结果如图4B 所示。在pH 4．0～9．0 范围内，探针的荧光强度均未发生明显变化。以上结果显示探针本身及其响应粘度后的荧光强度均不受光照和pH值的影响，说明探针具有较好的光稳定性和pH值稳定性。

图4 光照（A）及pH值（B）对探针荧光强度的影响Fig．4 Effects of light（A） and pH values（B） on fluorescence of probe 1 cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.3 探针的生物应用

2.3.1 荧光探针的细胞毒性研究利用MTT 法测定了不同浓度的探针溶液对细胞存活率的影响。将不同浓度（0～30 μmol·L-1）的探针溶液分别置于HeLa 细胞中培养24 h 后，细胞的存活率均达到85%以上（图5），证明探针溶液的浓度对细胞存活率影响不大，可应用于细胞微环境中粘度的检测。

图5 HeLa细胞在不同浓度探针1中的存活率Fig．5 The viabilities of HeLa cells in different concentrations of probe 1

2.3.2 细胞荧光成像研究探针响应粘度主要通过荧光强度变化进行。基于此，将HeLa 细胞与探针溶液共孵育30 min，可观察到微弱的荧光（图6A）；分别将CCCP 或鱼藤酮两种药物作用于HeLa细胞一段时间后，再加入探针溶液孵育30 min，可观察到细胞荧光强度明显增加（图6B、图6C、图6D）。这是因为CCCP和鱼藤酮均可导致细胞线粒体功能异常，进而引起细胞微环境的粘度增加。药物刺激诱导细胞前后，探针所呈现的明显的荧光增强现象表明该探针可对细胞微环境中的粘度变化进行有效检测。

图6 HeLa细胞的荧光成像Fig．6 Fluorescence imagings of HeLa cells A． cultured with probe 1（20 μmol/L） for 30 min；B． incubated with CCCP（10 μmol/L） for 10 h，and then incubated with probe 1（20 μmol/L）for another 30 min；C． incubated with rotenone（10 μmol/L） for 8 h，and then incubated with probe 1（20 μmol/L） for another 30 min；D． relative fluorescence intensity comparison of A，B and C，scale bar：20 μm

3 结 论

以1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物为电子受体，吲哚为电子供体，通过一步反应成功制备了具有D-π-A结构的荧光探针。通过考察探针的光学性质及细胞成像情况，系统探究了探针对不同粘度的响应性能及其对细胞中粘度变化的检测能力。结果表明，探针的荧光强度随着细胞粘度的增加而增强，且不受其它物质的干扰，探针对粘度具有较好的特异性。此外，探针对细胞的毒性较小，可以灵敏地检测药物刺激后细胞的粘度变化，证明该探针有进一步应用于生物体内粘度检测的潜力。