天麻治疗动脉粥样硬化作用机制探讨

程江豪，陈普，杨丽萍，段小花

云南中医药大学民族医药学院 云南省傣医药与彝医药重点实验室，昆明650500

动脉粥样硬化（AS）是颈动脉斑块、冠状动脉疾病和缺血性中风等心血管疾病的病理基础，是导致心血管性疾病的主要死亡原因之一。根据流行病学研究，超过60%的心血管疾病患者死亡归因于动脉粥样硬化性心血管疾病。AS的发生发展与血脂异常、内皮损伤和免疫性炎症等有关，但其具体病理生理机制仍未阐明。天麻为兰科天麻属植物天麻的干燥块茎，味甘、性平，归肝经，具有息风止痉、平肝潜阳、通络、补益之功效［1］。天麻在彝药“毒邪理论”中属撵内风毒药，风毒这种致病因素有“变动不居”之性，可分为外风毒与内风毒两类，外风毒由自然风邪所致，常侵袭人体头、肺及皮肤等处，而内风毒多深入脏腑［2］。动物实验表明，天麻和天麻素及其复方制剂能够改善早期AS小鼠主动脉病变和脂质沉积，调节血脂表达，稳定主动脉斑块，保护血管免受炎症损伤，提示天麻具有潜在的抗AS作用［3-5］。2022年9月—2023年4月，我们基于网络药理学和分子对接技术探讨天麻治疗AS的分子机制，旨在为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 天麻有效活性成分及其作用靶点筛选 在中医药百科全书数据库ETCM（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）、中药系统药理学数据库与分析平台TCMIP（http：//www.tcmip.cn/）中检索天麻的有效活性成分，筛选条件为胃肠吸收利用度“高”且药物相似性“两个Yes以上”。将检索获得的天麻有效活性成分导入SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），以分值＞0为筛选标准，获取其成分相关靶点，并通过文献补充未预测出的已知靶点，同时导入Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）标准化其靶点基因。

1.2 AS的疾病靶点筛选 在TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Drug Bank（www.drugbank.ca）、Gene Cards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//www.omim.org/）数据库中，以“atherosclerosis”为检索词检索AS的疾病靶点，取5个数据库的并集并去重。

1.3 药物—疾病核心靶点筛选 使用Venny2.1.0在线网站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将天麻有效活性成分的作用靶点与AS疾病靶点取交集，获得药物—疾病交集靶点，并绘制韦恩图。基于获得的交集靶点与天麻有效活性成分对应关系，建立有效活性成分—靶点调控网络，并将交集靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），限定物种为“Homo sapiens”，各节点置信度评分＞0.9，删除游离节点后建立PPI蛋白网络互作图。使用CytoScape3.9.1软件对PPI网络进行可视化分析，根据度值排名筛选药物—疾病核心靶点；利用CytoScape3.9.1软件中的Network Analyzer插件从网络拓扑学角度分析各节点，并根据网络拓扑参数筛选天麻的关键活性成分，取Degree值排名前5位。

1.4 药物—疾病交集靶点的功能预测 使用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），借助基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）对药物—疾病交集靶点的重要生物学进程和信号通路进行富集分析。以“OFFICIAL GENE SYMBOL”作为标识符，“Homo sapiens”作为物种类别，P＜0.01为条件。使用SRplot云平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在线工具进行绘图分析，结果呈现为气泡图。

1.5 天麻关键活性成分与疾病核心靶点的分子对接 将“1.3”筛选获得的天麻关键活性成分结构与药物—疾病核心靶点蛋白结构作三维结构可视化分子对接分析。借由Uniprot数据库获取核心靶点蛋白ID，通过蛋白质结构数据库（PDB）获得核心靶点蛋白的三维结构，从Pub Chem数据库获得天麻关键活性成分的三维结构，最后通过Pymol（https：//pymol.org/）、AutoDockTools（https：//autodocksuite.scripps.edu/adt/）、Vina（http：//vina.scripps.edu/）软件进行分子对接，计算结合能，用来表示天麻关键活性成分与核心靶点蛋白的结合能力。当结合能＜-5.0 kcal/mol表明二者具有较好的结合能力，＜-7.0 kcal/mol表明二者具有强结合能力。

2 结果

2.1 药物—疾病交集靶点筛选结果 共获得天麻有效活性成分15个，并补充中国药典2020版中天麻主要指标性成分天麻素，共获得有效活性成分16个（OSID码表1），预测作用靶点267个；其中香草醇未预测到作用靶点，通过文献［6］补充其靶点基因DRD2，共获得天麻作用靶点268个。AS疾病相关靶点共1 336个，将其与天麻的268个作用靶点取交集后，获得药物—疾病交集靶点97个，见OSID码图1。

表1 天麻关键活性成分与药物—疾病核心靶点的结合能（kcal/mol）

2.2 药物—疾病核心靶点筛选结果 将97个药物—疾病交集靶点导入Cytoscape1软件，建立天麻治疗AS的有效活性成分—靶点调控网络，见OSID码图2。天麻中的香草醛、棕榈酸、丁二酸、对羟基苯甲醛、双（4-羟基苯基）醚等16种有效活性成分作用于97个共同靶点基因，其中棕榈酸的作用靶点最多，有43个；其次是4-乙氧基甲基苯基-4'-羟基苯基醚与4-（4'-羟基苄氧基）苄基甲醚，分别作用于40个靶点。基于交集靶点建立PPI网络图（OSID码图3），利用Cytoscape3.9.1软件进行可视化分析（OSID码图4），根据Degree值排名前5名筛选出药物—疾病核心靶点AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1。

2.3 药物—疾病交集靶点的富集通路分析结果对97个药物—疾病交集靶点进行GO分析，共涉及相关条目468条，其中生物学进程（BP）240个、细胞组分（CC）114个、分子功能（MF）114个。生物学进程主要涵盖对脂多糖的反应、一氧化氮合成的正调控、凋亡的负调控、炎症调节等；细胞组件包含有薄膜、质膜、生物大分子复合体等；分子功能主要涵盖RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活的序列特异性DNA结合、内肽酶活性等（OSID码图5）。KEGG通路分析获得137条相关通路，主要富集于癌症通路、血清素能突触、脂质和AS、PPAR信号通路等，见OSID码图6。

2.4 天麻关键活性成分与药物—疾病核心靶点的分子对接结果 以药物—疾病核心靶点AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1为受体，以天麻关键活性成分棕榈酸、双酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羟基苯基醚、对羟基苄基乙醚及4-（4'-羟基苄氧基）苄基甲醚为配体，进行分子对接，结果显示，双酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羟基苯基醚、4-（4'-羟基苄氧基）苄基甲醚与药物—疾病核心靶点AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1的结合能＜-7.0 kcal/mol，见表1。经可视化处理后，均可借助氢键等分子间作用力结合，形成稳定的空间构象，见OSID码图7。

3 讨论

天麻别名为木浦（《彝族医药学》）、赤箭（《大理中药资源志》）、定风草、白龙皮（《现代临床中药志》）等，是常见且名贵的彝药。彝医常用其治疗小儿四六风、惊厥、抽搐、产后诸症、破伤风等实证，也可用于治疗头昏眼花、心悸、久病体虚不愈等虚证，提示天麻可能对心脑血管相关慢性虚劳性疾病有治疗作用［1］。《造药治病书》中记载，彝医治疗肺源性心脏病中多脏器瘀血证，可选取天麻30 g、三七15 g、滇党参100 g组成药方。《医学心悟》云：“湿痰壅遏者，书云，头旋眼花，非天麻、半夏不除是也。”这些钙化、沉着及脂质堆积在中医中常被视为痰湿。此外，因富含生物活性物质，天麻一直被公认为食疗与药物佳品，在药理方面具有降压、降脂、增强免疫力、脑保护等作用［7］，因此推测天麻或可作为治疗AS的潜在药物。

本研究首先基于ETCM等数据库筛选出双酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羟基苯基醚、4-（4'-羟基苄氧基）苄基甲醚等16个天麻有效活性成分及其抗AS的潜在靶点基因97个，构建了PPI蛋白互作网络图，筛选出AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1这5个药物—疾病核心靶点基因。这表明天麻通过多成分、多靶点发挥抗AS作用，这些药物—疾病核心靶基因极可能是天麻治疗AS的主要靶点基因。在天麻的有效活性成分中，我们分析得出双酚F、4-乙氧基甲基苯基-4'-羟基苯基醚、4-（4'-羟基苄氧基）苄基甲醚是抗AS的关键成分，且这三种成分为天麻所独有。双酚F是一种可用于制作抗氧剂及表面活性剂的芳香型有机化合物。研究表明，双酚F可能通过电压依赖性Ca2+通道抑制Ca2+的流入，减少细胞中Ca2+水平，从而发挥舒张血管作用，改善AS引起的高血压［8］。一些研究发现，双酚F可抑制脂肪细胞中脂联素的产生和分泌，可通过下调类固醇生成相关基因和蛋白质（STAR、CYP11A1和HSD3B1）表达降低类固醇水平，还可限制IRS-1/PI3K/AKT信号通路激活来抑制4T3-L3脂肪细胞中葡萄糖的消耗，从而起到降脂降糖作用［9-11］。4-乙氧基甲基苯基-4'-羟基苯基醚和4-（4'-羟基苄氧基）苄基甲醚作为仅来源于天麻的成分，目前相关报道很少，有待进一步进行体内外实验研究。上述研究表明，天麻有效活性成分可能在调节离子通道、抗氧化及降脂等方面发挥抗AS作用，这与AS的病理机制相符。

本研究通过STRING数据库对药物—疾病交集靶点进行PPI网络分析，预测出天麻抗AS的5个核心靶点AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1。FERNÁNDEZ-HERNANDO等［12］报道，在AKT1基因敲除小鼠中，内皮细胞和巨噬细胞凋亡增加，促炎基因表达增强，eNOS磷酸化减少，从而促进AS形成。PTGS2是驱动花生四烯酸代谢过程的重要酶，PTGS2上调与细胞黏附增加、细胞凋亡及炎症生成密切相关［13］。AS严重程度与PTGS2表达呈正相关，PTGS2可能作为AS的枢纽基因，或可作为其生物标志物［14］。ESR1作为主要雌激素受体之一，激活ESR1可减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡，抑制炎症反应和氧化应激，通过抗炎、抗氧化及凋亡等起到抗AS作用［15］。动物实验显示，AS大鼠PPARG蛋白表达水平明显降低，而上调PPARG蛋白表达可促进细胞胆固醇外排，维持脂质代谢的稳态［16］。另有研究显示，上调CASP3表达能够抑制氧化型低密度脂蛋白介导的人脐静脉内皮细胞凋亡，对细胞具有保护作用［17］。因此我们认为，上述5个核心靶点与AS发生发展密切相关，在天麻抗AS过程具有重要作用，这为今后的研究提供了方向。

本研究采用生物信息学方法进一步验证预测的天麻抗AS潜在靶点的作用。GO分析结果表明，天麻抗AS主要涉及对药物的反应、对脂多糖的反应、凋亡过程的负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、炎症应答等生物学进程，集中在炎症、氧化应激、脂质调节与抗凋亡等方面。已有研究表明，内皮细胞损伤、氧化应激、炎症、巨噬细胞和泡沫细胞的形成在AS的病理过程中起重要作用，如促炎症因子IL-6可通过PPARα和PGC-1α等途径调节高脂肪饮食诱导的小鼠心脏脂质代谢［18-22］。因此，天麻可能通过参与抗炎、抗氧化应激、降脂与抗凋亡等生物学进程，发挥其治疗AS的作用。

KEGG富集分析表明，脂质和AS通路、癌症通路、PPAR信号通路与AS的发生发展联系紧密。脂质和AS通路是富集得到的主要通路之一，共涉及15个靶点，其中PPI网络筛选的天麻抗AS核心靶点AKT1、PPARG、CASP3富集在此通路上。动物研究发现，天麻中的酸性多糖提取物通过抑制高脂饮食SD大鼠血清胆固醇的合成来抑制动脉粥样硬化风险指数［23］。癌症通路与多条信号通路相关，如NF-κB、AKT/mTOR等信号通路，涉及炎症、免疫及凋亡等多个环节，本研究中PPI网络筛选的5个天麻抗AS核心靶点AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3、ESR1均富集在此通路上。有报道表明，接受过癌症治疗（包括放疗）的癌症幸存者患动脉粥样硬化性心血管疾病的风险升高，患冠状动脉疾病的风险增加1.3～3.6倍，患动脉粥样硬化性疾病的风险增加1.7～18.5倍［24-25］。此外，细胞实验表明，天麻素可通过AKT/mTOR信号通路对甲基苯丙胺诱导的人多巴胺能神经母细胞瘤细胞自噬具有保护作用［26］。PPAR信号通路参与脂质代谢、炎症和氧化应激［27］。巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白会产生泡沫细胞，这是AS病变的标志。体外研究发现，天麻素可通过AMPK/FoxO1/TFEB信号通路诱导溶酶体生物生成和自噬，防止泡沫细胞形成［28］。此外，天麻素还可通过上调PPARβ和减轻硝化应激保护内皮细胞免受高血糖诱导的损伤，而内皮细胞损伤是AS产生的关键环节之一［29］。上述研究验证了本研究的准确性，为天麻抗AS后续的研究提供了依据。

综上所述，本研究基于网络药理学方法对天麻多成分、多靶点治疗AS的作用机制进行分析，并在此基础上进行分子对接论证，发现天麻可能通过4-乙氧基甲基苯基-4'-羟基苯基醚、4-（4'-羟基苄氧基）苄基甲醚、双酚F等天麻关键活性成分作用于PTGS2、ESR1等药物—疾病核心靶点，通过抗炎、抗氧化应激、降脂与抗凋亡等途径，调节癌症通路、脂质和AS通路及PPAR信号通路等通路发挥其抗AS作用。