复方兔胆止咳露制备及止咳效果研究

梁 云,牛首瑞,刘露露,邱金珠,魏淑东,任亚辉,宋 巍

(1.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州 433200;2.河南城建学院 生命科学与工程学院,河南 平顶山 467000)

中药在我国具有悠久的历史[1],最早可追溯至五千年前的神农氏时期,千百年来中药在我国的医疗卫生方面发挥了重要作用[2]。中药的主要来源为天然药物及其加工产品[3],分为植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物。

动物胆汁作为我国传统的中药材,在疾病治疗方面发挥着不可小觑的作用[4]。动物胆汁多味苦、性寒,具有清热解毒、止咳、通便等功效[5]。常见的动物胆有猪胆[6]、熊胆[7]、蛇胆[8]、牛胆和羊胆等,它们在止咳、清热解毒和提高免疫力等方面具有显著效果[9]。目前国内外对动物胆汁的理化性质及其药理作用的研究主要集中在熊胆、蛇胆和猪胆,而对兔胆的研究鲜有报道。在市场中,也见到过由动物胆开发出的药物,如霍胆丸、熊胆含片及八宝五胆药墨等,由兔胆开发出的药物却寥寥无几。

近年来,人们对于兔肉、兔皮毛、宠物兔等的需求越来越高,导致兔产业发展迅速[10],但是对于兔副产品的开发利用却仍然较少。兔胆作为兔的副产品之一,被大量丢弃,造成极大浪费[11]。据研究报道,兔胆不仅具有止咳、止痛、消炎、镇静、抗惊厥以及保护心肌等作用[12-13],而且有望成为常用的中药材。以兔胆为主要原料研发的各种治疗药品以及保健产品,可为兔胆的利用提供更多的可能性。本文对兔胆汁的止咳效果进行研究,并致力于开发出一种具有显著止咳效果的复方兔胆止咳露,为兔胆的开发利用提供科学的理论基础以及选择方向,更好地实现开发兔胆资源的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

昆明种小白鼠,体重(20±1.0)g,雌雄各半,均购于河南省动物实验中心。兔胆购于平顶山市新华区综合农贸市场,蜂蜜、薄荷叶、川贝、枇杷叶、百合、蛇胆川贝枇杷膏均购于张仲景大药房。氨水为化学纯。

1.2 仪器与设备

N-1300D-W型旋转蒸发仪:东京理化公司;18N/A型冷冻干燥机:宁波新芝生物科技股份有限公司;Performance-86立式超低温冰箱:赛默飞世尔公司。

1.3 兔胆粉的制备

取新鲜兔胆剪碎,收集胆汁后用双层纱布脱脂。脱脂后倒入大皿,每皿不得超过皿容积的2/3,用保鲜膜密封后放入-20 ℃冰箱2 h,待液体完全冷冻,再移入-80 ℃冷冻,6 h后取出,在密封的保鲜膜上扎孔,迅速放入预冷的冷冻干燥机。密闭冷冻干燥机,开启真空泵,进行冷冻干燥[14],48 h后迅速取出,研磨成粉末状,密封,4 ℃下保存。

1.4 中药水提物的制备

分别称取等量的中药材,用蒸馏水将300 g中药材浸泡30 min后,将浸泡好的中药材与1 500 mL蒸馏水一起倒入砂锅,武火煎煮45～60 min后用文火煎煮30～45 min。煎煮至砂锅中液体剩余200～250 mL倒出[15]。冷却至室温,用真空泵抽滤后,倒入大皿中分装,再用冷冻干燥机冷冻干燥制成粉末。

1.5 复方兔胆制剂的制备

1.6 氨水引咳法

参考文献[16]的方法,略加改进。昆明小鼠,雌雄各半,每组10只,随机分为PBS组,阳性对照组,兔胆粉低剂量组(0.4 g/kg)、中剂量组(0.6 g/kg)、高剂量组(0.8 g/kg),复方兔胆制剂低比例组(15)、中比例组(25)、高比例组(45)等8组。每日灌胃给药1次,连续5 d,末次给药l h后,将小鼠放入实验室自制喷雾箱内,之后开动雾化器,待氨水呈雾状喷入水箱20 s后,取出小鼠,置于清洁大烧杯内,对小鼠的咳嗽潜伏期 (以小鼠腹肌收缩,并张口吐舌作为咳嗽指标)和3 min内的咳嗽次数进行观察记录。

1.7 止咳实验

参照文献[17]和[18]的方法,略加改进。昆明小鼠,雌雄各半,随机分成阴性对照组、阳性对照组、受试药物组,每组10只。阴性对照组加入PBS,阳性对照组按25 mg/kg剂量给予蛇胆川贝枇杷膏,受试药物组分别为低剂量组(0.4 g/kg)、中剂量组(0.6 g/kg)、高剂量组(0.8 g/kg)的剂量给予兔胆粉和比例分别为低比例组(15)、中比例组(25)、高比例组(45)的剂量给予复方兔胆制剂。在第5 d给药1 h后用3.1%的氨水喷雾刺激,预先设定一个刺激时间20 s,刺激后观察小鼠出现典型的咳嗽次数,若咳嗽次数大于或等于3次,即记为有咳嗽;若小于3次,则记为无咳嗽。用序贯法(上下法)的原理求算小鼠半数引咳的喷雾时间(EDT50)。即若前一只小鼠未有咳嗽,则后一只就用低一级的时间刺激;相反则后一只小鼠用高一级的时间刺激,相邻两个刺激时间的对数差取0.08。

EDT50=lg-1c/n

式中:n为动物数;c为rx值的总和;r为每剂量组的动物数;x为剂量(即喷雾时间)的对数。

根据各组的EDT50计算R值,R=实验组EDT50/阴性对照组EDT50,R≥130%则认为有镇咳作用,R≥150%则镇咳作用显著。

2 结果与分析

2.1 兔胆粉止咳效果的研究

在探究单独兔胆粉的止咳效果的研究中,如表1所示,阳性对照组和低剂量组(0.4 g/kg)、中剂量组(0.6 g/kg)、高剂量组(0.8 g/kg)的EDT50分别为35.403 8、32.888 2、41.787 3、31.286 5,根据各组的EDT50值与阴性对照组的EDT50比值计算出R值。结果如图1所示,阳性对照组和中剂量组(0.6 g/kg)的R值分别为139.32%、164.41%,大于130%,表明具有止咳效果,其中中剂量组(0.6 g/kg)的R值大于150%,表明其具有显著镇咳作用。低剂量组(0.4 g/kg)和高剂量组(0.8 g/kg)的R值分别为129.42%、123.11%,均小于130%,表明其不具有止咳效果。

表1 兔胆粉止咳实验结果

图1 不同胆粉浓度的R值

2.2 兔胆复方止咳露的止咳效果研究

在探究兔胆与中药的最佳止咳效果复方制剂的止咳实验中,兔胆和中药的比例分别为低比例组(15)、中比例组(25)、高比例组(45),各中药之间的比例为11111。采用药物蛇胆川贝枇杷膏作为阳性对照,如表2所示,阳性对照组和低比例组(15)、中比例组(25)、高比例组(45)的EDT50分别为45.818 4、45.818 4、45.818 4、39.541 2,根据各组的EDT50值与阴性对照组的EDT50比值计算出R值。结果如图2所示,阳性对照组、低比例组(15)、中比例组(25)、高比例组(45)的R值分别为187.06%、187.06%、187.06%、161.43%,均大于150%,表明其均具有显著镇咳效果。另外低比例组(15)和中比例组(25)与阳性对照组的止咳效果相一致。

表2 复方制剂止咳实验结果

图2 兔胆粉与中药不同比例组R值

3 结论

鉴于胆酸具有清热解毒功效[19],兔胆在止咳方面的开发利用有待进一步研究。在探究单独兔胆粉的止咳效果时,低剂量组(0.4 g/kg)和高剂量组(0.8 g/kg)的R值分别为129.42%、123.11%,均小于130%,表明其不具有止咳效果。而阳性对照组和中剂量组(0.6 g/kg)的R值分别为139.32%、164.41%,均大于130%,表明有止咳作用,其中中剂量组(0.6 g/kg)的R值大于150%,表明其具有显著镇咳作用。

单味中药虽具有止咳功效,但复方制剂在止咳方面具有更好的表现。本文参考蛇胆川贝止咳糖浆中胆汁与中药的比例设置了比例范围,用蛇胆川贝枇杷膏作为阳性对照,阳性对照组、低比例组(15)、中比例组(25)、高比例组(45)的R值分别为187.06%、187.06%、187.06%、161.43%,均大于150%,表明其均具有显著镇咳效果。

将兔胆粉组的R值与复方制剂组的R值相比较发现,复方制剂组的止咳效果明显优于兔胆粉单独作用的止咳效果。这可能是因为复方兔胆止咳制剂的每种成分都具有止咳功效,且不同成分之间具有协同效果[20]。各个成分具体如何发挥协同作用,仍需进一步研究。

通过一系列实验发现,兔胆粉给药量在0.6 g/kg时,对小鼠有显著镇咳效果,在与中药混合后,兔胆粉与中药的比例在15和25之间时具有显著镇咳效果,当比例大于45时,镇咳效果会减弱。整体来说,复方制剂对小鼠的止咳效果优于兔胆粉作用的止咳效果,复方兔胆止咳露具有显著的止咳效果,这为复方兔胆止咳露的新药开发奠定了一定的基础,为兔胆的资源利用提供了理论依据。