以水蚤为指示生物探究表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵的急性毒性

张军政,靳淑博,杨治广,陈 硕,郝晴圆,杨静也,王晨曦,贺晓晓,孙文浩,孔令展

(河南城建学院 河南省水体污染防治与修复重点实验室,河南 平顶山 467000)

随着科学技术的不断创新和发展,越来越多的新化合物被合成出来,这些化合物的出现对于人类有利有弊,对环境也如此。其对环境会产生什么样的影响需要通过实验进行判断。

水蚤(大型蚤)具有个体小、繁殖快、易获取、便于操作、二次处理量小等优点,利用水蚤对水生生物安全的影响进行评价是一种快速高效的途径。张晶晶等[1]对比了吡丙醚、氟铃脲、除虫脲、灭蝇胺、噻嗪酮、虫酰肼6种昆虫生长调节剂以及吡虫啉、三唑磷、高效氯氰菊酯、氟虫腈、丁硫克百威原药5种杀虫剂对大型蚤的急性毒性。Claudia等[2]研究并建立了农药对大型蚤的急性毒性模型。Tinkov等[3]研究了有机化合物结构对大型蚤急性毒性的影响。Xu等[4]研究了塑料颗粒对大型蚤的急性毒性。王倓倓[5]研究了多氯联苯醚在巢湖中分布特征及其在大型蚤体内的富集转化和毒性效应。高磊[6]研究了印染废水的生物毒性测试方法。王娜[7]及胡奕[8]研究了纳米银对大型蚤毒性的影响。堵锡华等[9]研究了苯砜基乙酸酯类化合物对大型蚤急性毒性的结构信息指数。李渭印等[10]进行了次氯酸钠、表面活性剂、苯酚对大型蚤的急性毒性研究。李建凤等[11]对芳烃类化合物结构与大型蚤急性毒性关系进行了相关的研究。廉洁等[12]探究了三氯生对蚤状溞急性毒性。

十二烷基三甲基氯化铵是一种无色或淡黄色胶体,化学式C15H34NCl,可溶于水和乙醇。它的化学稳定性良好,耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱,具有优良的渗透性、乳化性、柔软性、抗静电性和杀菌性能,因此在化工等领域使用较为广泛。十二烷基三甲基氯化铵在使用过程中会通过各种途径进入自然水体,对水生态产生影响。利用水体中常用的指示生物水蚤探究十二烷基三甲基氯化铵对水生生物的影响较为方便安全,同时与利用个体较大的鱼等动物相比还能节约资源,保护环境。

1 材料与方法

1.1 试验蚤种

试验水蚤为河北省邢台市鱼艺传统金鱼渔场引种并在实验室经过3年稳定驯化培养后的水蚤。随机选取20只健康母蚤,将母蚤置于水族箱中进行繁殖培养,培养水采用静置3 d的自来水,水族箱置于阳光散射光能够照射到的地方,用小球藻喂养。种群密度为每升水约50只,温度为室温。经过母蚤孤雌生殖纯系培养3代以后,选用培养3代以上的健康幼蚤为试验蚤。

1.2 试验试剂

重铬酸钾为河北省保定化学试剂厂生产的分析纯试剂,十二烷基三甲基氯化铵为天津市光复精细化工研究所生产的分析纯试剂。

1.3 试验仪器设备

水族箱材质为有机玻璃,规格为900 mm×600 mm×300 mm;分组试验采用100 mL常规玻璃烧杯;药品和水蚤的称量使用万分之一电子分析天平。

1.4 试验方法

参考《GB/T 16125—2012大型溞急性毒性实验方法》进行相关试验。试验期间不喂食,定时观察记录水蚤的死亡数,以水蚤心脏停止跳动为死亡标准,得出半致死浓度24 h LC50。

1.5 试验蚤的敏感性测试

采用国际标准《水质——大型蚤运动抑制的测定》(ISO6341:1996)进行敏感性测试。以重铬酸钾作为敏感性测定毒物,对水蚤进行24 h LC50测试试验,检验所用水蚤是否符合敏感性要求。重铬酸钾对水蚤的急性毒性试验结果见表1。3次试验水蚤的24 h LC50平均值为1.304 mg/L,3次试验浓度变化较小,误差为0.54%,说明试验水蚤具有非常好的重复性与稳定性。重铬酸钾对水蚤24 h有效浓度的国际标准值为0.9～2.0 mg/L,说明所用水蚤的敏感性符合试验要求。

表1 重铬酸钾对水蚤的急性毒性试验

1.6 十二烷基三甲基氯化铵试验浓度预实验

采用静置3 d的自来水为培养水体,十二烷基三甲基氯化铵水溶液浓度0.10 mg/L、1.00 mg/L为预实验浓度,经24 h急性毒性试验后,0.10 mg/L浓度条件下的30只水蚤死亡1只,1.00 mg/L浓度条件下30只水蚤全部死亡。因此,十二烷基三甲基氯化铵对水蚤的急性毒性效应浓度按对数浓度设定为:0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.16 mg/L、0.25 mg/L、0.40 mg/L、0.63 mg/L、1.00 mg/L。

1.7 数据统计与分析方法

根据受试物浓度与水蚤死亡数,利用统计软件SPSS 26(IBM SPSS Statistics 26),结合数据绘图工具Origin 2021和Microsoft Office Excel 2016对实验结果进行绘图分析。

2 结果与讨论

2.1 十二烷基三甲基氯化铵对水蚤的急性毒性效应

采用静置3 d的自来水为培养水体,十二烷基三甲基氯化铵线性对数浓度0.10～1.00 mg/L为试验浓度,24 h急性毒性试验浓度与水蚤死亡数关系如图1所示。

图1 24 h浓度与水蚤死亡数关系图

空白对照组30只水蚤生长正常,未有死亡现象,说明所用培养水体对水蚤生长代谢不会产生毒性作用,在十二烷基三甲基氯化铵溶液浓度为0.10 mg/L时24 h死亡数为1只,由图1可以看出,水蚤死亡数随着十二烷基三甲基氯化铵溶液浓度的变大而增加。浓度为0.10～0.25 mg/L时,水蚤死亡数低于3,说明在此浓度范围内水蚤对十二烷基三甲基氯化铵不敏感。当溶液浓度增加到0.40 mg/L时,水蚤死亡数从3指数式快速增大到9,说明水蚤对十二烷基三甲基氯化铵的敏感性突然增大。浓度为0.63 mg/L时,水蚤死亡数为21只。浓度为1.00 mg/L时,30只水蚤全部死亡。

不同浓度的十二烷基三甲基氯化铵在不同时间段内对水蚤的影响如图2所示。前4 h内水蚤的死亡数基本为0,说明在前4 h内水蚤对十二烷基三甲基氯化铵的敏感性较低。从第4 h到第8 h的这段时间,在浓度为0.63 mg/L和1.00 mg/L的条件下水蚤死亡数分别从1、2增加到7、23,水蚤死亡数量的突然增大说明水蚤对十二烷基三甲基氯化铵的耐受性在8 h左右,且从第8 h到24 h时间段内浓度越高水蚤的死亡数越高。

图2 不同浓度不同时间段水蚤死亡数的关系图

图3是16 h和24 h水蚤死亡数随浓度的变化与指数Exp3P2模型曲线。由图3a可以看出,16 h的两条曲线几乎重合,说明水蚤的死亡数随着十二烷基三甲基氯化铵溶液浓度的增大呈指数增长。由图3b可以看出,十二烷基三甲基氯化铵溶液浓度为0.10～0.63 mg/L时,其水蚤的死亡曲线与指数拟合曲线几乎重合,溶液浓度为1.00 mg/L时水蚤的死亡数低于指数拟合曲线,水蚤试验数由30只改为60只,相同条件下试验发现60只水蚤也全部死亡,说明试验时间为24 h、溶液浓度为1.00 mg/L的条件下,水蚤的死亡数与指数拟合曲线偏离较大的原因是试验水蚤的样本数量不同。

a 16 h

16 h和24 h水蚤死亡数与溶液浓度之间的关系可用指数Exp3P2模型描述,其指数拟合曲线方程为

y=ea+bx+cx2

(1)

其中16 h和24 h指数拟合曲线所对应方程(1)的具体参数值如表2所示。

表2 16 h和24 h对应方程(1)的具体参数值

由表2可知,16 h时R2值为0.999 29,表明水蚤的死亡数与十二烷基三甲基氯化铵溶液浓度在Exp3P2模型下拟合度非常高,说明水蚤的死亡数与溶液浓度之间的关系符合Exp3P2指数模型,水蚤的死亡数随着溶液浓度的增大呈指数增长的趋势。24 h同理可得,R2值为0.999 17,其拟合度也非常高,水蚤的死亡数也符合随溶液浓度的增大呈指数增长的规律。

将表2数据输入SPSS 26软件所得结果如下:

(1) 卡方检验:由皮尔逊拟合优度检验得,在样品浓度不取对数时得到的卡方值为0.609;在样品浓度取对数时得到的卡方值为11.638;卡方值越接近零时拟合效果越好,因此采用样品浓度不取对数时的卡方值作为最终的检验值。

(2) 概率估算:由参数估算值得到线性回归方程为:y=-2.388+4.717x,95%置信区间为3.513～5.921。概率为0.500时对应的估算值为0.506,下限值为0.451,上限值为0.576。

由内插法计算十二烷基三甲基氯化铵转换后概率响应如图4所示,当y=0.5(概率为50%)时,x的值为0.625,即十二烷基三甲基氯化铵的24 h LC50=0.625 mg/L。说明十二烷基三甲基氯化铵在浓度为0.625 mg/L的条件下对水生生物即有较高毒性,对水生态影响较大。十二烷基三甲基氯化铵能溶解红细胞,水蚤属于枝角类动物,其血液含有血红素,血红素溶于血浆,肌肉、卵巢和肠壁的细胞中也含血红素,因此十二烷基三甲基氯化铵可通过破坏血红素对水蚤生长代谢产生影响,从而导致其死亡。

图4 十二烷基三甲基氯化铵转换后概率响应图

2.2 水蚤急性毒性分级

样品的急性毒性主要根据动物经口、经皮半数致死量(LD50)、吸入半数致死浓度(LC50)进行分级,由受试动物体重与样品的半数致死量(浓度)进行评价。水体中污染物对动物的急性毒性分级不但与污染物浓度有关,还与受试动物体重有关。

2.2.1 水蚤称重实验

水蚤称重实验设计两种称重方法。

方法一:将水蚤分为大水蚤(≥4 mm)、中水蚤(1～4 mm)、小水蚤(≤1 mm),如图3所示。这3种水蚤分别随机选取10只,用吸水纸将其表面水分吸干,用接种环将其移放至称量纸上,称量后记录数据并将水蚤放回原处,再重新随机选取10只水蚤,重复操作以上步骤,称取10次,得到大水蚤、中水蚤、小水蚤称量10次的数据,分别求取平均值,再将得到的3组平均值求取平均值,为0.007 61 g。

方法二:不分大小随机选取十只水蚤按照方法一的步骤进行称重,称取10次,求取平均值,为0.006 48 g。

由图5可知,将水蚤实体用显微镜全部放大70倍,获得的图片经测量得到随机选取的大水蚤实际长度为5 mm。同理可得中水蚤实际长度为2 mm,小水蚤实际长度为1 mm。据此划分大、中、小水蚤的范围为:长度≤1 mm的水蚤划分为小水蚤;长度在1～4 mm的水蚤划分为中水蚤;长度≥4 mm的水蚤划分为大水蚤。

小水蚤

在探究十二烷基三甲基氯化铵对水蚤影响的试验中,每个烧杯的试验蚤数量都是10只,因此将10只水蚤作为一个整体所得到的平均质量用于后续步骤的比例缩放。将两种方法所得10只水蚤平均质量再取平均值(0.007 045 g),得到最终将用于后续推算步骤中使用的数值。

2.2.2 水蚤急性毒性分级推算

由于国家目前对药品急性毒性的划分是经过大鼠或者小鼠实验得到结果进行划分,没有通过水蚤急性毒性试验进行划分,所以根据目前已知的急性毒性分级推算得到以水蚤为研究对象的急性毒性分级。

推算步骤如下:根据前面水蚤称重实验所得10只水蚤平均质量为0.006 67 g,用于急性毒性使用小鼠体重以18～25 g、大鼠180～240 g、豚鼠200～250 g、家兔2.0～2.5 kg、猫1.5～2.0 kg为宜。表3为工业毒物急性毒性分级标准。

表3 工业毒物急性毒性分级标准

将小鼠作为研究对象,用于急性毒性使用小鼠体重以18～25 g,取其平均值为21.5 g。10只水蚤平均质量为0.007 045 g,即小鼠的平均质量是10只水蚤平均质量的3 052倍。由表4可知,小鼠吸入2 h不同毒性分级LC50值为已知。将这些数值乘以12得到的数值,再除以3 052即可得到新的毒性分级以及相对应的浓度范围。将最终得到的数值作为水蚤在溶液中接触24 h LC50值。结果如表4所示。十二烷基三甲基氯化铵的24 h LC50为0.625 mg/L,经过查询比对发现推算得到的十二烷基三甲基氯化铵毒性与其他实验得到的结果基本一致,属于高毒性物质。

表4 新急性毒性划分等级

李渭印等[10]研究了次氯酸钠、表面活性剂、苯酚对大型蚤的急性毒性并根据相关毒性评价标准对次氯酸钠、表面活性剂、苯酚进行等级划分。其试验结果表明次氯酸钠、表面活性剂、苯酚对大型蚤的24 h LC50分别为0.216 mg/L、8.590 mg/L、41.295 mg/L。划分结果为:次氯酸钠属于高毒等级,表面活性剂属于中毒等级,苯酚属于低毒等级。将其试验结果按照表4急性毒性划分等级进行毒性划分,结果为:次氯酸钠属于高毒等级,表面活性剂属于中等毒级,苯酚属于低毒等级,所得结果和李渭印等得到的结果一致。

3 结论

以水蚤(大型蚤)为研究对象,探究了十二烷基三甲基氯化铵对水蚤的急性毒性影响,并设计相关试验得到了以水蚤为研究对象的急性毒性划分等级,结果如下:

(1)十二烷基三甲基氯化铵的24 h LC50值为0.625 mg/L,对应急性毒性划分等级为高毒性,对水生生物毒性较高,如果进入自然水体中的浓度高于LC50值,将对水生态环境造成一定的负面影响,产生安全风险。

(2)对目前已知的急性毒性等级划分进行改进,得到了以水蚤为研究对象的新的急性毒性划分等级,并通过相关案例的对比验证其准确性。

(3)水蚤的急性毒性试验可以快捷方便地初步评估判断水体中是否含有有毒有害物质及其是否会对周围生态环境产生一定的影响。