普美显增强MRI及DWI相关定量参数对原发性肝癌肝脏储备功能及CD34、Glypican-3表达水平的预测价值

陈松,黄泽和,李莹,李伟雄

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界恶性肿瘤中居第三位,肝细胞癌是最常见的原发性肝癌,近年来,每年新发的肝癌病例逐年增加[1]。原发性肝癌的治疗主要有手术治疗、局部治疗和经肝动脉化疗栓塞治疗等方式,其中手术治疗是最常用的治疗方式[2]。术前准确评估肝脏储备功能可预测患者对手术的耐受程度及肝脏的恢复能力,有助于保证手术安全。此外,早期预测患者预后对及早选择合适的治疗方式也至关重要。近年来,随着分子生物学研究的发展,许多与肝癌预后有关的分子标志物相继被研究者们报道。血管内皮因子CD34是一种I型跨膜蛋白,已被证实在肝癌患者癌组织中的表达显著升高,且高表达的CD34与肝癌患者的不良预后和早期复发转移显著相关[3]。相关研究显示,磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)在肝癌组织中的表达显著上调;并且多因素分析结果显示,Glypican-3在肝癌的发生发展中起关键作用,高表达Glypican-3与肝癌恶性生物学表征密切相关,可预测患者预后不良[4]。因此,评估CD34和Glypican-3的表达水平具有一定意义。但目前这些分子标志物的检测都需要采集活体组织样本,并结合病理结果进行,因此都具有创伤性。多项研究显示,以钆塞酸二钠(Gd-EOB-DTPA,商品名:普美显)作为对比剂的增强MRI在肝癌诊断及肝脏储备功能的评估中具有一定作用[5,6]。扩散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)可通过测量表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值来定量测量肿瘤内部水分子运动情况,在肝癌诊断等方面具有重要意义[7]。然而目前还未有研究探讨普美显增强MRI联合DWI相关定量参数与肝脏储备功能和预后分子标志物表达的关系,本研究旨在探讨普美显增强MRI联合DWI相关定量参数与原发性肝癌肝脏储备功能及CD34、Glypican-3表达水平的关系。

材料与方法

1.研究对象

本研究为前瞻性研究,纳入2021年1月至2022年3月入院就诊及治疗的96例原发性肝癌患者作为研究对象,其中男71例,女25例,平均年龄(51.34±6.28)岁。此外,选择50例肝良性结节患者作为对照组,其中男37例,女13例,平均年龄(50.85±5.81)岁。病例纳入标准:①经穿刺活检或手术病理确诊;②穿刺或手术前行肝脏Gd-EOB-DTPA增强MRI 扫描;③年龄18～70岁;④临床病理资料完整;⑤未接受过其他抗肿瘤治疗。病例排除标准:①合并其他部位肿瘤;②患有其他原发性肝疾病;③合并严重心、脑血管、肾系统疾病。本研究最终共纳入96例原发性肝癌患者,临床分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期28例,Ⅲ期40例,Ⅳ期15例;分化程度:低分化21例,中分化40例,高分化35例。肝癌组与对照组患者的年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究获得了本院伦理委员会批准(批号:20201235C),所有研究对象均自愿参与研究,并签署了知情同意书。

2.MRI检查方法

MRI检查采用西门子Skyra3.0 TMRI扫描仪,受检者取仰卧位,头先进,将体部线圈置于受检者剑突位置以保证肝脏位于磁体中心处。首先进行平扫检查,T1WI序列扫描参数:TR 4.10 ms,TE 1.33 ms,视野380 mm×296 mm,矩阵320×256,层厚3 mm,层间距0.6 mm;T2WI序列扫描参数:TR 2500 ms,TE 86 ms,视野380 mm×380 mm,矩阵352×352,层厚5 mm,层间距1.5 mm。平扫后进行DWI检查,扫描参数:视野380 mm×308 mm,层厚5 mm,TR 6100 ms,TE 58 ms,b值取0、1000 s/mm2,矩阵134×134。最后采用Gd-EOB-DTPA为对比剂行动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast enhancement magnetic resonance imaging,DCE-MRI)检查,以1.0 mL/s流率将剂量为0.025 mmol/kg的Gd-EOB-DTPA经肘正中外周静脉注入,注射结束后以20 mL生理盐水冲管(流率1.0 mL/s)。注入对比剂后行动脉期(25～30 s)、门静脉期(55～65 s)、平衡期(150～180 s)扫描,延迟约20 min行肝胆期扫描。所有病例的ADC图及肝胆期图像以DICOM格式传输到西门子副台syngo.via软件。由两位医生共同在syngo.via软件上行肝胆期感兴趣区(region of interest,ROI)设置,在肝门层面分别选择左肝、右肝前叶、右肝后叶肝实质内设置面积约(100±5) mm2的ROI,注意避开血管、胆管、病灶等,保持不同时相的ROI大小、位置尽量一致,以syngo.via软件上肝胆期ROI为参考设置预描期ROI,在相同层面上下各加一层进行三维勾画。以左肝、右肝前叶及右肝后叶信号强度(signal intensity,SI)的均值作为全肝平均信号强度SI。肝脏增强前信号强度以SIpre表示,肝脏肝胆期信号强度以SIpost表示,根据公式REHBP=(SIpost-SIpre)/SIpre计算出每例患者的肝胆期相对信号强化程度(relative enhancement at hepatobiliary phase,REHBP);在ADC图上测量ADC值,ROI大小、位置与肝胆期ROI一致。

3.肝脏储备功能的评定

所有患者在MRI检查前后一周内、穿刺或手术前进行肝脏储备功能的检查。由两位临床专家共同进行Child-Pugh肝功能评分和分级,并达成一致。将总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间、腹腔积液和肝性脑病的评分相加,总评分为5～15分。评分越高说明肝脏储备功能越差。根据总分对Child-Pugh肝功能进行分级:A级为5～6分,B级为6～9分,C级为≥10分。

4.免疫组化及结果判读

取肝癌患者的组织样本,行常规制作石蜡切片,脱蜡、水化及热修复后,滴加双氧水,封闭内源性过氧化物酶,水洗后滴加山羊血清白蛋白于室温下封闭10 min,分别加入CD34(1:1000)、Glypican-3(1:1000)蛋白一抗,于4℃下孵育过夜。次日加入二抗,在室温下孵育30 min。二氨基联苯胺显色、苏木素复染,最后脱水、透明、封片。根据染色强度和阳性细胞数,综合判断癌组织中CD34、Glypican-3蛋白的表达情况。以棕色或棕黄色染色判定为阳性细胞,阳性细胞率计分方式如下:<10%计为0分,10%～25%计为1 分,26%～50%计为2分,51%～75%计为3分,>75%计为4分;染色强度评分方法如下:无染色为0 分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,褐色为3分。总分为染色强度和阳性细胞比例评分的乘积,如果总分≥3分即判定为高表达,总分<3分则认为低表达。

5.统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差表示,组间比较采用t检验。应用受试者工作特征 (receiver operating characteristic,ROC)曲线分析MRI定量参数对肝脏储备功能和预后分子标志物表达的预测效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.两组MRI定量参数比较

原发性肝癌患者的REHBP和ADC值均显著低于肝脏良性结节患者,差异有统计学意义(P<0.05,表1,图1、2)。

图1 原发性肝癌合并门脉癌栓患者,男,55岁,肝功能分级为B级。a)MRI图像(T1增强前)测得SIpre=218.13 ms;b)普美显增强扫描肝胆期图像,SIpost=424.58 ms;c)DWI图像,ADC值=1.076×10-3mm2/s。图2 原发性肝癌伴肝硬化失代偿期患者,男,56岁,肝功能分级为B级。a)MRI图(T1增强前)测得SIpre=252.61 ms;b)普美显增强扫描肝胆期图像,SIpost=828.43 ms;c)DWI图像,ADC值=0.887×10-3mm2/s。

表1 两组MRI定量参数比较

2.不同肝脏储备功能肝癌患者的MRI定量参数比较

Child-Pugh肝功能B+C级患者的REHBP和ADC水平均显著低于A级患者,差异有统计学意义(P均<0.05,表2)。

表2 不同肝脏储备功能肝癌患者的MRI定量参数比较

3.不同临床病理特征肝癌患者的MRI定量参数比较

低分化患者的REHBP和ADC值均显著低于中高分化患者,差异有统计学意义(P<0.05,表3);Ⅲ～Ⅳ期患者的REHBP和ADC值均显著低于Ⅰ～Ⅱ期患者,差异有统计学意义(P<0.05,表4)。

表3 不同分化程度肝癌患者的MRI定量参数比较

表4 不同分期肝癌患者的MRI定量参数比较

4.不同CD34、Glypican-3表达水平肝癌患者的MRI定量参数比较

CD34高表达患者的REHBP和ADC值均显著低于低表达患者,差异有统计学意义(P<0.05,表5)。Glypican-3高表达患者的REHBP和ADC值均显著低于低表达患者,差异有统计学意义(P<0.05,表6)。

表5 不同CD34表达水平肝癌患者的MRI定量参数比较

表6 不同Glypican-3表达水平肝癌患者的MRI定量参数比较

5.MRI定量参数预测肝脏储备功能及预后分子标志物的效能分析

ROC曲线分析结果显示,REHBP和ADC值预测肝脏储备功能的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.901(95%CI:0.840～0.962,P<0.001)和0.861(95%CI:0.784～0.937,P<0.001),敏感度和特异度分别为88.9%和83.3%、83.3%和81.7%(图3)。REHBP和ADC值预测CD34高表达的AUC为0.923(95%CI:0.866～0.980,P<0.001)和0.866(95%CI:0.783～0.948,P<0.001),敏感度和特异度分别为96.9%和77.4%、83.1%和80.6%(图4)。REHBP和ADC值预测Glypican-3高表达的AUC为0.879(95%CI:0.791～0.966,P<0.001)和0.933(95%CI:0.884～0.982,P<0.001),敏感度和特异度分别为85.7%和80.8%、81.4%和96.2%(图5)。

图3 MRI定量参数预测肝脏储备功能的ROC曲线。图4 MRI定量参数预测CD34高表达的ROC曲线。图5 MRI定量参数预测Glypican-3高表达的ROC曲线。

讨 论

肝脏储备功能指的是肝脏受损后机体维持正常机能的代偿能力,除了机体所需的代谢、蛋白质合成或降解、解毒功能以外的创伤修复能力和肝脏再生能力。精确的个体化的术前肝脏储备功能可作为临床上评估肝脏耐受手术方式的重要指标,甚至是影响手术成败的关键[2]。此外,早期预测患者预后对治疗方式的选择也有重要指导意义。已有大量研究表明CD34在多种肿瘤的发生、发展机制中发挥作用,如乳腺癌[8]、大肠癌[9]等。相关研究显示,CD34是肝细胞癌中与新生血管形成相关的生物标志物,表达水平升高预示着预后不良[3]。相关研究表明Glypican-3在肿瘤性组织,如肝细胞癌[10]、胃癌[11]和黑色素瘤[12]中可见阳性表达,并且可用于鉴别良恶性肝细胞肿瘤,与肝细胞癌患者术后转移和复发相关[4]。本研究旨在探讨普美显增强MRI及DWI相关参数与肝脏储备功能和预后分子标志物表达的关系。

普美显是一种肝胆特异性MRI对比剂,已广泛应用于肝局灶性病变的检测和定性诊断。它可被正常肝细胞选择性摄取,入血后仅通过门脉系统吸收排泄,几乎不存在肝肠循环,在肝功能评价中具有很高的潜在价值[13]。DWI通过呈现组织间水分子扩散运动受限情况,在肝癌的诊断和疾病进展的评估中也发挥着重要作用[7]。本研究结果显示,相较于肝脏良性结节,肝癌患者的REHBP和ADC值均显著降低,这与之前研究报道的结果一致[5,7]。肝功能不良、Ⅲ～Ⅳ期、低分化肝癌患者的REHBP和ADC值均显著低于肝功能良好、Ⅰ～Ⅱ期和中高分化的患者。这一结果表明,REHBP和ADC值可用于肝癌的诊断、肝脏储备功能及疾病进展的评估。练玉清等[5]的研究结果显示,普美显增强MRI肝胆期REHBP在一定程度上能反映肝脏储备功能,并且与吲哚菁绿15min滞留率具有较好的相关性。王润强等[14]的研究结果显示,慢性乙型肝炎患者的肝实质ADC值在一定程度上可用于评价肝损害程度和肝脏储备功能。ROC曲线分析结果也显示REHBP和ADC值在肝癌患者肝脏储备功能的评估中具有一定价值。相关研究显示,对于肝功能异常的患者,肝脏对普美显的吸收量将会降低,因此强化程度可判断肝实质对普美显的摄取标准[2,5]。此外,REHBP、ADC值与肝癌预后分子标志物的表达水平间也存在着相关性。CD34和Glypican-3高表达预示着患者预后不良,ROC曲线分析结果也表明REHBP和ADC值可用于预测CD34和Glypican-3的表达水平,因此在一定程度上可预测患者预后。

综上所述,普美显增强MRI及DWI相关参数在一定程度上可预测原发性肝癌患者肝脏储备功能及预后分子标志物表达。