miRNA在鼻咽癌诊断和治疗中的应用研究进展▲

黄俊辉 钟文良 何 兰 史红健 蔺 婷,4 何迎春,3

(1 湖南中医药大学,湖南省长沙市 410208; 2 湖南中医药大学第一附属医院,湖南省长沙市 410007;3 湖南省中医药防治眼耳鼻咽喉疾病与视功能保护工程技术研究中心,湖南省长沙市 410208;4 中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室,湖南省长沙市 410208)

【提要】 鼻咽癌是一种起源于鼻咽黏膜的上皮性癌,在我国主要高发于南方地区。miRNA是一类非编码的小RNA分子,在组织、血清、血浆和其他体液中稳定性表达,通过与互补的靶mRNA结合,导致mRNA翻译抑制或mRNA降解,在细胞增殖、分化过程中发挥核心作用,并在恶性肿瘤的发生、发展中发挥着促癌或抑癌作用。miRNA异常表达可通过改变癌基因和抑癌基因的表达来参与鼻咽癌的发生、转移和耐药性,在鼻咽癌的诊断和治疗中具有重要作用。研究异常表达的miRNA及其作用机制,进一步阐明鼻咽癌的发病机制,可为鼻咽癌的诊断和治疗提供新的研究方向。本文对近年来miRNA在鼻咽癌的发生、发展、诊断、治疗和预后评估中的作用进行综述,以期为miRNA调控鼻咽癌的基础研究及其转化应用提供科学依据和新思路。

鼻咽癌是全球常见的恶性肿瘤之一,起源于鼻咽黏膜上皮,其发病具有显著的地域特点,在我国主要高发于广西和广东两地[1-2]。已有研究表明鼻咽癌的发病与EB病毒感染、饮食、环境因素和基因突变等密切相关[1]。2020年GLOBOCAN数据显示,2020年全球新增鼻咽癌患者133 354例,新增鼻咽癌死亡人数为80 008人,而我国鼻咽癌的年龄标准化发病率为3/10万,位居世界前列[3]。鼻咽癌起病部位隐匿,早期症状不明显,原发癌病灶小,易被忽略或误诊,鼻咽癌患者初诊时基于MRI检查的咽后淋巴结转移发生率高达70%～86%[4-6]。目前,放疗和/或化疗、靶向治疗、免疫治疗、中医药治疗等多学科诊疗为鼻咽癌治疗的主要模式。单独或联合化疗的调强放疗为早期或局部晚期鼻咽癌的主要治疗手段,但化疗耐药性和放疗抵抗性可导致鼻咽癌复发、远处转移,增加治疗难度,影响患者预后[7-9]。早期筛查诊断、复发后治疗和改善预后已成为鼻咽癌临床研究的重点。近年来,有关miRNA的研究日益增多,患者体液和鼻咽癌组织中的差异表达miRNA为鼻咽癌的诊疗带来了新的生物标志物和治疗靶点。

miRNA是一类非编码的小RNA分子,平均长度为22个核苷酸,在细胞增殖、分化和存活过程中发挥重要作用。编码miRNA的基因大多位于内含子区域,并含有各自的启动子区域。在一般情况下,DNA序列转录为原代miRNA,再加工为前体miRNA,最后经过切割和解离形成成熟的miRNA。在多数情况下,miRNA主要与靶标mRNA的3′非翻译区相互作用,诱导mRNA降解和抑制翻译,同时miRNA也与其他区域相互作用,包括5′非翻译区、编码序列和基因启动子[10]。在鼻咽癌中,miRNA具有确切的抑癌或促癌作用,与鼻咽癌的发生、发展密切相关。未来十年,有关鼻咽癌的研究将集中在探索其发病的生物学机制,完善筛查和分期策略,识别与预后风险分层和治疗相关的生物标志物,优化不同患者亚群的治疗策略,以及开发新的治疗方法[1,11]。本文对近年来miRNA在鼻咽癌的发生、发展、诊断、治疗和预后评估中的作用进行综述,以期为miRNA调控鼻咽癌的基础研究及其转化应用提供科学依据和新思路。

1 miRNA在鼻咽癌发生、发展中的作用机制

1.1 miRNA的促癌作用 抑癌基因失活是鼻咽癌发生的重要因素,具有抑癌作用的miRNA可以负向调节编码蛋白质的癌基因,而具有促癌作用的miRNA通常抑制已知的肿瘤抑制因子[12]。发挥促癌作用的miRNA在鼻咽癌中的表达水平通常是上调的,并通过靶基因来调节相关信号通路从而发挥作用,通常是激活下游与致癌相关的信号通路。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路是一种与致癌相关的信号通路,其通过激活上皮-间质转化,促进癌细胞的增殖、侵袭和转移[13-14]。miRNA可通过激活PI3K/AKT信号通路,促进鼻咽癌的发生、发展。Huang等[15]发现鼻咽癌组织中miR-192表达增加,miR-192通过直接靶向下调视网膜母细胞瘤基因1,来激活PI3K/AKT信号通路,从而促进鼻咽癌细胞的生长、迁移和侵袭。Li等[16]的研究显示,miR-141-3p通过PI3K/AKT信号通路负性调控NME1基因,从而促进鼻咽癌细胞的增殖和转移。还有学者发现甲状腺激素受体/组蛋白去乙酰化酶1相关阻遏蛋白在鼻咽癌中上调,其通过激活PI3K/AKT/原癌基因c-JUN信号通路,来诱导miR-4652-3p的表达,从而促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移[17]。miRNA对鼻咽癌的调控是多途径、多靶点的,其通过激活致癌相关信号通路—PI3K/AKT信号通路来发挥促癌作用,而PI3K/AKT信号通路亦可调节促癌相关miRNA的表达来影响鼻咽癌的表型[18]。Mu等[19]发现,miR-141-3p通过靶向抑制肝癌缺失基因1表达,激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路,促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。以上的研究表明,具有促癌作用的miRNA主要通过激活致癌相关信号通路中的相关信号分子,促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移。

1.2 miRNA的抑癌作用 miRNA除了具有促癌作用,还具有抑癌作用。在鼻咽癌中,部分miRNA的表达下调,可能发挥着类似于抑癌基因的作用,其抑癌作用主要通过调节信号通路中的关键分子实现。目前,相关研究多为通过探讨鼻咽癌中的miRNA表达情况来了解其抑癌作用。例如,miR-1在鼻咽癌中表达下调,下调miR-1的表达可以调节细胞外基质的黏附功能,激活PI3K/AKT信号通路以抑制p21/p27的表达,并通过影响PI3K/AKT信号通路上游调控因子局部黏着斑激酶导致细胞周期蛋白依赖性激酶1表达上调,这表明miR-1通过参与调控癌细胞有丝分裂,在抑制鼻咽癌的增殖、凋亡和转移中发挥重要作用[20]。Zong等[21]的研究表明,miR-204在鼻咽癌细胞中表达下调,而C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)在鼻咽癌细胞中表达上调,上调miR-204可通过调控核因子κB信号通路来抑制CXCR4表达,从而抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移。Fan等[22]的研究结果显示,在鼻咽癌中miR-506表达下调,过表达miR-506通过直接靶向下调Zeste增强子同源物2,来促进鼻咽癌细胞凋亡,并抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移及上皮-间质转化。而CXCR4和Zeste增强子同源物2均具有促癌基因的作用[23-24]。另外,miRNA可通过下调促癌激酶(如细胞周期蛋白依赖性激酶9、双皮质素样激酶1)的表达,抑制鼻咽癌的发生[25-26]。Zhang等[26]发现,miR-223-5p在鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞中的表达显著下调,而过表达miR-223-5p可能通过靶向下调双皮质素样激酶1抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。

1.3 miRNA的网络化调控机制 miRNA在鼻咽癌相关基因的复杂调控网络中具有独特作用,各个miRNA并非独立存在,而是存在相互影响、相互作用、相互竞争的关系,并且存在一定的反馈机制,其调控的内容包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭、细胞转移和细胞干性等。Zhu等[27]在GEO数据库中发现miR-106A-5p在鼻咽癌中过表达,其在临床Ⅳ期鼻咽癌患者中的表达明显高于临床Ⅰ～Ⅲ期鼻咽癌患者。Zhu等[27]还发现早期生长反应因子1和性别决定区Y框蛋白9在miR-106A-5p启动子上共结合并促进鼻咽癌细胞过表达miR-106A-5p,miR-106A-5p靶向结合BTG3抗增殖因子的3′非翻译区,激活丝裂酶原活化蛋白激酶信号通路,显著抑制鼻咽癌细胞自噬,促进鼻咽癌细胞的恶性生物学行为。这一研究提示miRNA受多种因子的调节,同时也通过作用于多个靶标发挥多重作用。He等[28]在HONE-1细胞株中发现,下调miR-25可使Wnt/β 连环蛋白(β-catenin)信号通路失活,从而抑制鼻咽癌细胞增殖,并促进鼻咽癌细胞凋亡。而Lin等[29]报告,miR-574-5p通过抑制叉头框蛋白N3表达,上调β-catenin和转录因子4的表达,激活Wnt/β-catenin信号通路,从而促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在不同miRNA的作用下,Wnt/β-catenin信号通路分别处于失活状态和激活状态,这可能是由同一个miRNA作用于多个不同靶基因,或多个miRNA共同作用于同一信号通路的多个靶点所致,这也反映了miRNA在癌症中的调控机制是多靶点、多途径、网络化的。不同miRNA之间也存在一定的相互竞争[30]。具有抑癌作用的miRNA也作用于PI3K/AKT信号通路和Wnt/β-catenin信号通路,如miR-384[31]、miR-873[32]、miR-1[20]、miR-34a[33]、miR-99a[34]等,通过抑制致癌相关信号通路来抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为。Zeng等[31]的研究显示,miR-384通过靶向下调母亲DPP同源物5(果蝇)使Wnt/β-catenin信号通路失活,抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为和体内肿瘤生长,与miR-574-5p[30]、miR-25[28]、miR-103[35]对Wnt/β-catenin信号通路的影响及促癌作用相反。此外,miRNA表达具有一定的反馈作用,在肿瘤干细胞中表现尤为明显。Lv等[32]发现,上调miR-873的表达可抑制AKT信号通路,从而抑制鼻咽癌干细胞的自我更新和致瘤性。一项最新研究发现,miR-200c通过调控鼻咽癌干细胞从而影响鼻咽癌细胞的耐药性,原癌基因c-Myc通过直接结合位于miR-200c转录起始点上游1kb片段内的两个E-box位点,在转录时抑制miR-200c的表达,而miR-200c通过与原癌基因c-Myc的3′非翻译区结合,在转录后抑制原癌基因c-Myc的表达,提示原癌基因c-Myc与miR-200c之间存在负反馈环;c-Myc的过表达干扰了这一反馈环,激活上皮-间质转化,诱导癌症干细胞表型,提高药物耐药性,而miR-200c可以抵消原癌基因c-Myc的上述生物学效应[36]。miRNA的异常表达可增强肿瘤细胞的干性,通过反馈环的形成和致癌相关性信号通路的结构性激活,促进肿瘤转移和耐药性形成[37]。

综上所述,鼻咽癌的发生受到多种信号通路的网络化调控,完善miRNA在鼻咽癌中的调控机制研究,进一步阐明鼻咽癌发生的内在分子机制,将有助于为寻找用于鼻咽癌诊断和治疗的新型生物标志物。然而,目前的研究仍多针对单一miRNA,多个miRNA的协同作用可能是未来的研究方向。

2 miRNA在鼻咽癌诊断中的作用

迄今为止,鼻咽癌的诊断方法主要有CT检查、MRI检查、PET/CT检查、鼻咽镜检查、血液EB病毒检测和组织病理学检查等。但这些方法存在不少缺点,例如诊断准确率较低、检查过程耗时、程序复杂及需要专业的管理技术等,临床应用受到限制[38]。鼻咽癌的早期治愈率较高,通过早期有效的人群筛查,可提高鼻咽癌的治疗效果,预防肿瘤转移和改善预后。然而,开展复杂耗时的大规模筛查显然不合适,实现便捷、非侵入性、高效、准确及安全的早期诊断将是更为合理的选择。由于miRNA在机体内具有稳定性好、特异性强和敏感性高的特点,因此不少学者围绕miRNA在鼻咽癌中的诊断价值尤其是早期诊断价值展开研究。

目前,利用生物信息学方法、第二代测序技术、高通量芯片技术等方法分析不同来源样本中miRNA表达差异,以挖掘潜在的关键miRNA,可为鼻咽癌的筛查与诊断提供新的候选生物标志物[39-41]。Zhang等[42]对200例鼻咽癌患者和189例健康献血员(正常对照)血浆中的miRNA表达水平进行分析,发现在鼻咽癌患者中miR-144-3p、miR-17-5p、miR-20a-5p和miR-205-5p的表达持续上调,而let-7b-5p、miR-206-5p和miR-140-3p的表达下调;通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估上述7个miRNA联合诊断鼻咽癌价值,发现其曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.807,敏感性和特异性分别为73.5%和75.7%,且诊断效能优于单个miRNA,并且在合并EB病毒感染和肿瘤TNM分期中均具有诊断价值。Zou等[43]通过比较208例鼻咽癌患者和238例健康献血者(正常对照组)的血清miRNA表达水平,发现鼻咽癌患者血清let-7b-5p、miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-24-3p表达水平明显高于正常对照组,上述5个miRNA联合诊断鼻咽癌的AUC为0.916,且具有较高的敏感性和特异性,可作为鼻咽癌诊断的潜在生物标志物。Jiang等[44]选择了7个具有代表性的异常表达miRNA,利用60例鼻咽癌患者和40例健康对照者进行验证,并建立了基于SEV-miRNA的模型诊断,ROC曲线证实由miR-134-5p、miR-205-5p和miR-409-3p组成的诊断模型在鼻咽癌亚组(EB病毒阴性和EB病毒阳性鼻咽癌、早期和晚期鼻咽癌)中的诊断性能良好,AUC为0.83～0.92。Wu等[45]对22例新诊断的鼻咽癌患者和25例健康对照者的唾液样品进行微阵列miRNA表达谱分析,选择12个显著下调的miRNA进行实时定量PCR 验证和分析,ROC曲线分析结果提示这12个miRNA联合诊断鼻咽癌的AUC为0.999,灵敏度为100%,特异性为96%,当仅选择6个明显异常表达的miRNA进行联合诊断时,仍然获得较高的诊断准确性(AUC为0.941,灵敏度为95%,特异性为80%)。该研究首次提出将唾液miRNA作为鼻咽癌诊断的新型生物标志物的适用性。miRNA诊断模型具有相当高的诊断价值,但是不同模型用于诊断的肿瘤分型差异性大,所包含的miRNA的重复率低,这可能是由研究样本量小、人群和地区差异大等原因所致,未来需要开展大规模、大样本量、多中心试验以进一步发掘出更多、更合适的miRNA诊断模型。

体内外研究结果表明miRNA在鼻咽癌的诊断中具有一定的价值[46]。微阵列数据集分析显示,miR-1278是鼻咽癌组织中表达最低的miRNA,miR-1278的低表达水平与患者的总生存期短和化疗反应差显著相关[47]。有研究表明,miR-450b-5p的下调与淋巴结转移和TNM分期密切相关[48],而与单独应用miRNA或TNM分期相比,miRNA联合TNM分期具有更好的预后评估价值[49]。miRNA和TNM分期的联合不仅可应用于鼻咽癌的诊断,还可用于预测鼻咽癌的进展,为制订下一步治疗策略提供依据[49]。因此,作为非侵入性的动态监测手段,同时应用血清、血浆和唾液中多个miRNA作为生物标志物,通过建立miRNA诊断模型,为鼻咽癌诊断提供分子谱分析方法,并纳入鼻咽癌分期和治疗前风险分层管理因子,可提高鼻咽癌早期诊断的准确率。

3 miRNA在鼻咽癌治疗中的作用

目前,鼻咽癌的治疗手段主要包括适形调强放疗、同步放化疗、辅助化疗和诱导化疗等[1]。鼻咽癌对放疗高度敏感,早期治疗以放疗为主,然而高剂量的放疗仍然会导致患者出现放射敏感性减弱和远期的毒副作用(如吞咽障碍、听力障碍和脑损伤)等[50]。提高鼻咽癌放化疗的精确度、有效性和敏感性,减轻毒副作用,已成为当前鼻咽癌治疗的主要研究方向。在不少肿瘤治疗过程中可见miRNA表达失调,而miRNA参与了肿瘤放疗和化疗的作用机制。有研究表明,miRNA模拟物及抗miRNA分子等在临床前研究中显示出良好的前景[11]。

3.1 miRNA在鼻咽癌放疗中的作用 鼻咽癌对电离辐射高度敏感,放疗是非转移性鼻咽癌的主要治疗手段[3]。放疗主要通过破坏细胞DNA链从而直接杀死癌细胞,包括双应变断裂和单应变断裂[51]。细胞凋亡是放疗治疗恶性肿瘤最重要的作用机制[52],miRNA主要通过调节促凋亡基因、抗凋亡基因、DNA损伤修复基因和细胞周期调控基因(如B细胞淋巴瘤2家族成员、p53、Caspase和细胞周期素依赖性激酶1)来影响鼻咽癌细胞的放射敏感性,诱导鼻咽癌细胞凋亡。抑制鼻咽癌细胞中p53的表达可以减少细胞凋亡,提高细胞存活率,而上调miR-4270表达可通过负调控Tp53的mRNA和蛋白表达水平,来抑制鼻咽癌细胞中p53的生物学效应,促进细胞凋亡[53]。Tian等[54]的研究表明,miR-124过表达可靶向抑制细胞连接黏附分子A来抑制鼻咽癌细胞干性,在体内外增强鼻咽癌细胞的放射敏感性。Xie等[55]通过转染miR-195-3p模拟物使鼻咽癌细胞过表达miR-195-3p,发现这一方法可靶向下调细胞周期素依赖性激酶1,抑制鼻咽癌细胞生长,降低放射抵抗,促进细胞凋亡,阻碍细胞周期进程。此外,放疗后鼻咽癌的自噬抑制是鼻咽癌放射抵抗性的重要因素,EXO-miR-197-3p通过抑制AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白磷酸化和热休克蛋白A5介导的自噬,来抑制鼻咽癌进展和放射抵抗性[56]。Du等[57]的研究结果表明,miR-138-1-3p通过靶向下调畸胎瘤衍生生长因子来降低蛋白酪氨酸激酶2/信号转导与转录激活因子3信号通路的活性,调节耐受辐射的鼻咽癌细胞株C666-IR和HK-1R的放射敏感性。

除鼻咽癌组织细胞中的miRNA水平受放疗影响外,血清中的miRNA也参与了鼻咽癌的放射抵抗性,提示放疗过程中非侵入性监测患者血清中的miRNA水平将有助于调整放疗方案。Li等[58]发现存在鼻咽癌放射抵抗性的患者的血清hsa-miR-1281和hsa-miR-6732-3p表达显著下调,hsa-miR-1281预测放射敏感性的AUC为0.750,敏感性和特异性分别为87.5%和57.1%,而 hsa-miR-6732-3p预测放射敏感性的AUC为0.696 ,敏感性和特异性分别为56.3%和78.6%。

3.2 miRNA在鼻咽癌化疗中的作用 目前,同步放疗和化疗是治疗局部晚期鼻咽癌患者的标准方案,然而化疗耐药性仍是晚期患者和复发患者治疗中的主要问题,并且化疗的毒副作用显著,提高药物敏感性及减轻药物的毒副作用仍然是目前亟须解决的问题。miRNA与鼻咽癌细胞的化疗耐药性密切相关,异常表达的miRNA通过调节转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和雌激素相关受体α等因子来影响癌细胞耐药性。以铂类药物为基础的药物治疗是目前鼻咽癌的主要化疗方法[7]。有学者通过对耐药鼻咽癌细胞开展研究发现,miR-106a-5p通过与芳香烃受体核转位因子2的3′非翻译区结合调节顺铂的耐药性,抑制miR-106a-5p表达可降低鼻咽癌细胞的存活率和集落形成,促进细胞凋亡,改善耐药性[59],由此证实了miRNA在鼻咽癌化疗中的作用。Bissey等[60]研究发现,TGF-β抑制miR-34c的表达和上调性别决定区Y框蛋白4的表达,导致鼻咽癌细胞对顺铂耐药。还有研究显示,接受同步放化疗治疗的鼻咽癌患者的总生存期与miR-449b表达水平呈负相关,上调miR-449b可诱导TGF-β水平降低,导致前体TGF-β活化诱导的顺铂耐药性增加[61]。在耐药鼻咽癌细胞中miR-137表达下调,将miR-137转染至鼻咽癌细胞,可降低雌激素相关受体α mRNA的稳定性,增加鼻咽癌细胞的化疗敏感性,可降低耐药细胞的葡萄糖消耗量,以及细胞中乳酸和三磷酸腺苷的产生速率[62]。由此可见,研究鼻咽癌化疗耐药性的miRNA机制可为寻找新的治疗药物和靶点提供理论依据。miRNA作为治疗靶点具有巨大的开发潜力,miRNA模拟物、miRNA抑制剂和miRNA靶向治疗显示出良好的临床开发前景, 例如miR-515-5p作为鼻咽癌中5-氟尿嘧啶和顺铂耐药性的新型调节剂,或许可成为鼻咽癌靶向治疗的新靶点[63]。

4 小 结

miRNA具有高度保守性、调控作用显著的特点,参与鼻咽癌细胞的增殖、转移、上皮-间质转化、自噬和凋亡等过程,作为鼻咽癌的诊断、治疗和预后评估的生物标志物具有很大潜力。值得注意的是,在miRNA的作用机制中,不仅存在单个miRNA调控癌症的途径,还有多个miRNA相互调控的网络,这些网络与它们调控的靶标具有相互反馈作用[64]。miRNA可以作为鼻咽癌诊断和预后评估的生物标志物,而多个miRNA联用可提高鼻咽癌的诊断准确性,并且血清检测的创伤性小,肿瘤局部扩散的风险更低。此外,miRNA在鼻咽癌的放疗和化疗中也发挥重要作用,阐明miRNA在放疗抵抗性和化疗耐药性中的作用有助于开发新的治疗靶点和药物,减轻患者痛苦,延长患者生存时间。然而,miRNA在鼻咽癌中的诊断准确性、治疗效果和安全性等方面仍存在一些挑战,因此在大规模临床应用前,亟须通过基础研究、临床试验和队列研究解决miRNA治疗的毒副作用等问题。