QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定糌粑中15种真菌毒素的含量

蒋晓宏 ,霍宗利 ,朱 峰 ,周永林 ,沈 菲*

(1.拉萨市疾病预防控制中心,拉萨 850000;2.江苏省疾病预防控制中心,南京 210000)

糌粑是藏族人民的传统食品,它是以产于西藏、青海、甘肃等高寒地区的青稞为原料,经除杂、清洗、晾干、翻炒、磨粉等工艺制成的粉末状食物,也被称为青稞炒面[1]。糌粑拥有非常丰富的营养成分,富含蛋白质、糖、脂肪、纤维素、氨基酸和矿物质,缺少瓜果蔬菜的高寒地区的人民经常食用,可避免营养缺乏[2-4]。与全国其他地区的粮食产业相比,糌粑产业相对比较落后,管理、生产体系尚未规范,生产过程中可能存在产品质量风险。糌粑产品中含有约6%(质量分数)的水分,其在温度和湿度均较高的环境存放,极易吸潮结块,促进了微生物的生长,进而变质,影响糌粑的品质[5-6]。

真菌毒素是真菌产生的次生代谢产物,具有致癌、致畸、致突变的特性,易导致急性或慢性中毒。迄今为止,已有超过500种真菌毒素被发现,研究主要聚焦于二十多种对人类和动物有明确毒性作用的化合物。根据真菌毒素的化学结构及其与人类和动物健康的相关性,可将其划分为主要真菌毒素(包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素、伏马菌素、棒曲霉素和玉米赤酶烯酮类毒素)、新兴真菌毒素[链格孢霉毒素和新兴镰刀菌毒素(白僵菌素和恩镰孢菌素)]和其他真菌毒素等[7]。这些毒素可通过多种方式污染食品,如直接感染谷类等农作物,污染原料导致咖啡、果汁等加工食品受到污染,饲料中的毒素迁移导致肉、蛋、奶等动物源性食品污染等[8]。

糌粑作为藏族独有的传统主食,在原料生长与采收、成品加工、贮藏及运输中都易受到产毒真菌的侵染,并且可能被多种产毒真菌同时侵染[9],但目前鲜有相关报道,因此有必要建立糌粑中真菌毒素的检测方法。近年来,QuECh ERS-超高效液相色谱-串联质谱技术由于其高效、简便和环保的特点,能够有效地提取和净化基质中多种真菌毒素,广泛应用于食品中真菌毒素的分析[10-13]。

本工作以Qu ECh ERS 作为样品前处理方法,选取了植物源性食品中主要真菌毒素污染物[脱氧雪腐镰刀菌烯醇类、黄曲霉毒素类、伏马毒素类、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、杂色曲霉毒素(ST)等]作为研究对象,提出了超高效液相色谱-串联质谱法测定糌粑中15种真菌毒素含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC-30A 型超高效液相色谱仪;QTRAP 5500型三重四极杆质谱仪;2-16KL 型台式冷冻离心机;1-14型台式离心机;OA-SYS型氮吹仪;Vortex-Genie 2型涡旋混合器。

单标准溶液:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ACDON)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ACDON)、HT-2 毒素(HT-2)、T-2 毒素(T-2)、ZEN 标准溶液的质量浓度均为100 mg·L－1;伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、伏马毒素B3(FB3)、ST 标准溶液的质量浓度均为50 mg·L－1;OTA 为10 mg·L－1,黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素B1(AFB1)标准溶液的质量浓度均为2 mg·L－1,黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素B2(AFB2)标准溶液的质量浓度均为0.5 mg·L－1。使用时用乙腈稀释至所需质量浓度。

混合标准溶液:分别取适量的15种真菌毒素标准溶液,用乙腈稀释成DON、15-ACDON、3-ACDON、HT-2的质量浓度为1 mg·L－1,其余真菌毒素质量浓度为0.1 mg·L－1的混合标准溶液,于－20 ℃保存。

硫酸钠、氯化钠、硫酸镁均为分析纯;乙腈、甲酸均为色谱纯;试验用水为质谱级。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);流量0.3 mL·min－1;柱温40 ℃;进样量10μL;流动相A 为0.2%(体积分数,下同)甲酸溶液,B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.5 min时,B为5%;1.5～4.5 min时,B 由5%升至23%;4.5～11.0 min 时,B 由23% 升至50%,保持3.0 min;14.0～16.0 min时,B 由50%升至100%;16.0～16.1 min 时,B 由100%跳转至5%,保持0.9 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,离子源温度550 ℃,正离子(ESI＋)、负离子(ESI－)模式同时扫描;多反应监测(MRM)模式;毛细管电压5 500 V(ESI＋模式)/－4 500 V(ESI－模式);气帘气流量31.8 L·min－1,雾化气流量8.4 L·min－1,辅助气流量6.8 L·min－1。其他质谱参数见表1,其中“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

准确称取1 g(精确至0.001 g)均质过的糌粑粉末,置于50 mL 离心管中,加入5 mL 水和10 mL含10%(体积分数,下同)甲酸的乙腈溶液,涡旋振荡提取10 min,加入盐析剂(4 g硫酸钠,1 g氯化钠),涡旋振荡10 min,以转速10 000 r·min－1离心10 min。取1.5 mL上清液,置于装有150 mg硫酸镁、100 mg C18、100 mgN-丙基乙二胺(PSA)的2 mL净化管中,涡旋振荡5 min,以转速14 800 r·min－1离心10 min。取0.8 mL 上清液,氮吹至近干,用0.4 mL 20%(体积分数)乙腈溶液复溶,涡旋混合5 min,过0.22μm 滤膜后,按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 仪器工作条件的选择

采用针泵方式进样,将200μg·L－1单标准溶液以7μL·min－1的流量注入质谱仪,在ESI＋、ESI－模式下,分别进行Q1母离子和Q3子离子扫描,ZEN 在ESI－模式下响应高,其他14种真菌毒素均在ESI＋模式下响应较好,分别选取最合适的离子对,优化最优的去簇电压、碰撞能量等参数,得到最佳质谱参数,具体见1.2.2节。

试验考察了不同水相[0.1%(体积分数)氨水、0.2%甲酸溶液、水]和不同有机相(甲醇、乙腈)组合的流动相对化合物响应值和分离度的影响。结果表明,对于含有乙酰氧基团的真菌毒素,乙腈-水体系的洗脱效果和化合物的响应均好于甲醇-水体系,因为乙酰氧类化合物在甲醇溶剂中不稳定[14]。由于待测真菌毒素多数是ESI＋模式扫描,甲酸可增强ESI＋模式下大部分真菌毒素的离子化效率,提高目标化合物的响应,虽然甲酸对ESI－下ZEN 的灵敏度略有影响,但是能满足检测需求。综合考虑,试验选用0.2%甲酸溶液-乙腈体系为流动相。

在优化的仪器工作条件下,得到的提取离子色谱图见图1。

图1 15种真菌毒素的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of 15 mycotoxins

2.2 提取剂的选择

试验考察了甲醇、乙腈作为提取剂时目标物的提取效率。结果表明:甲醇极性小,溶解性强,提取时基质效应较为明显,且对DON 的提取效率影响较大;乙腈的选择性更好,可有效减少脂肪、色素等杂质的提取。综合考虑,试验选择乙腈作为提取剂。

由于伏马毒素类和赭曲霉毒素类真菌毒素具有羧基,水溶性强,对酸具有敏感性,加入甲酸可增强其稳定性,提高提取效率,因此试验进一步比较了乙腈、含1%(体积分数,下同)甲酸的乙腈溶液、含5%(体积分数,下同)甲酸的乙腈溶液、含10%甲酸的乙腈溶液对真菌毒素回收率的影响。结果表明:使用乙腈提取时,FB1、FB2、FB3和OTA 的回收率均低于5.0%,其余真菌毒素的回收率在50.0%～80.0%内;使用含1%甲酸的乙腈溶液提取时,OTA的回收率提高至30.0%,FB1、FB2、FB3的回收率均未变化,其余真菌毒素的回收率在60.0%～85.0%内;使用含5%甲酸的乙腈溶液提取时,FB1、FB2、FB3的回收率在25.0%～45.0%内,OTA 的回收率提高至90.0%,其余真菌毒素的回收率均在75.0%以上;使用含10%甲酸的乙腈溶液提取时,15种真菌毒素的回收率均大于75.0%。因此,试验选择含10%甲酸的乙腈溶液作为提取剂。

2.3 净化剂及其用量的选择

C18主要用于去除脂质等非极性杂质;PSA 用于消除各种有机酸、色素、糖,并同时消除部分水;石墨化碳黑(GCB)可去除类甾体、叶绿素等色素,但GCB具有强吸附性,在使用时部分被测物不易洗脱。试验探讨了不同用量的PSA、C18和GCB 对15种真菌毒素回收率的影响,每个试验重复3次。其中,净化剂中硫酸镁的主要作用是吸附水分,对目标化合物的回收不会有影响,故此处不再讨论硫酸镁的用量。

固定PSA、C18用量均为100 mg,考察了不添加GCB以及GCB用量为5,10,20 mg时对真菌毒素回收率的影响,如图2所示。

图2 GCB用量对15种真菌毒素回收率的影响Fig.2 Effect of GCB amount on the recovery of 15 mycotoxins

由图2可知:GCB的用量对部分真菌毒素的回收率影响很大。相较于不添加GCB,GCB 用量为5 mg时ST 的回收率下降了50%;GCB用量增加至20 mg 时ST 的回收率低于5.0%,AFB1、AFB2、OTA 的回收率也明显下降。GCB对具有平面分子结构的杂质(如甾醇和叶绿素等)吸附效果好,对具有平面分子结构或不完全平面分子结构的真菌毒素也有较强的吸附作用[15]。ST、AFB1、AFB2具有明显的平面结构,易被GCB吸附,因此GCB对这些真菌毒素的回收率影响较大。综合考虑,样品处理过程中不使用GCB。

固定PSA 用量为100 mg,不加入GCB,试验考察了不添加C18以及C18用量为50,100 mg时对真菌毒素回收率的影响,如图3所示。

图3 C18用量对15种真菌毒素回收率的影响Fig.3 Effect of C18 amount on the recovery of 15 mycotoxins

由图3可知:不添加C18时,FB2的回收率低于50.0%,随着C18用量的增加,FB2的回收率有明显提升;C18用量对3-ACDON、AFG1、HT-2、T-2、OTA 回收率的影响不大;AFG2、AFB2的回收率在C18用量为50 mg时最优,其余真菌毒素的回收率均在C18用量为100 mg时最佳。固定C18用量为100 mg,不加入GCB,考察了不添加PSA 以及PSA 用量为50,100 mg时对真菌毒素回收率的影响,如图4所示。

由图4可知:不添加PSA 时,AFB1和ST 的回收率低于50.0%,二者回收率均随着PSA 用量的增加而提高;HT-2的回收率有随着PSA 用量增加而降低的趋势,AFG2、FB3、T-2、OTA 的回收率在PSA 用量为50 mg时最优,其余真菌毒素的回收率在PSA 用量为100 mg时最佳。

综合考虑,试验最终优化得到的净化剂用量为PSA 100 mg和C18100 mg,在此条件下各真菌毒素回收率均达到75.0%以上。

2.4 基质效应

基质效应可能会导致峰形拖尾、线性差及重现性差,可利用不同浓度水平的目标化合物在空白溶剂中的标准曲线斜率和在基质溶液中的工作曲线斜率进行计算[16]。试验采用空白糌粑基质提取液和空白溶剂分别配制标准溶液系列,获得工作曲线和标准曲线(相关系数均大于0.990 0),基质效应＝(工作曲线的斜率－标准曲线的斜率)/标准曲线的斜率×100%。结果表明:T-2、3-ACDON、AFG1的基质效应绝对值均在20.0%～50.0%内,AFB2、FB2、ZEN 的基质效应绝对值均在10.0%～20.0%内,其余真菌毒素的基质效应绝对值均小于10.0%。说明大多数真菌毒素的基质效应较小,只有3种真菌毒素的基质效应绝对值在20.0%～50.0%内。使用内标和基质校正标准曲线(即工作曲线)定量是常用的去除基质效应的方法,而真菌毒素种类较多,找到对应的内标难度较大,且真菌毒素的内标价格非常昂贵,为了降低检测成本,试验采用基质校正标准曲线进行准确定量,可以消除基质效应的影响。

2.5 工作曲线、检出限与测定下限

取阴性糌粑样品,按照试验方法制备空白基质提取液,用其配制混合标准溶液系列,其中DON、15-ACDON、3-ACDON、HT-2 的质量浓度为5.0,20,50,100,200μg·L－1,其余真菌毒素的质量浓度为0.5,2.0,5.0,10,20μg·L－1。以化合物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线,得到的线性范围、线性回归方程、相关系数见表2。

表2 线性参数、检出限及测定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

以3倍信噪比(S/N)确定化合物的检出限(3S/N),以10 倍信噪比确定化合物的测定下限(10S/N),结果见表2。

2.6 精密度与回收试验

选取空白糌粑样品,按2 倍测定下限(低)、10倍测定下限(中)、20倍测定下限(高)等3个浓度水平进行加标回收试验,每个浓度水平选取6个平行样,按照试验方法测定,计算真菌毒素的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。由表3可知,15种真菌毒素在糌粑中的回收率为75.8%～105%,测定值的RSD 为0.10%～9.5%。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 样品分析

从拉萨市购买不同厂家的糌粑共10批,包括糌粑(3批)、黑糌粑(2批)、豌豆糌粑(1批)、水磨糌粑(1批)、仲嘎糌粑(1批)、罗布琼孜糌粑(1批)、萌动糌粑(1 批),按照试验方法进行测定。结果表明,10批糌粑中有7批检出OTA,检出率高达70%,检出量为0.4～32.3μg·kg－1,其余真菌毒素均未检出,说明OTA 污染的概率较高。国家标准GB 2761－2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定谷物及其制品中OTA 的限量为5μg·kg－1,试验发现两批糌粑中OTA 含量超标,亟需重视糌粑中真菌毒素的安全性,并进行相关监控。

本工作采用Qu ECh ERS 样品前处理方法,以超高效液相色谱-串联质谱法测定糌粑中15种真菌毒素的含量。方法前处理简单、灵敏度高、专属性强、精密度好、稳定可靠,可用于糌粑中真菌毒素的含量测定和安全性防控。