白及抗炎药效部位在骨关节炎治疗中的作用及机制研究

吴园园 徐红仙 黎晓梅 彭苏玉 王佳茂 蒋福升 叶建晨

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病，以疼痛、肿胀、活动障碍为主要症状［1］。其发病机制复杂多样，但基本认同炎症反应在疾病初始阶段扮演重要作用。中药白及具有收敛止血、消肿生肌等功效，对诸多内外损伤均具有促修复作用［6-7］。前期研究发现，白及醇提物可显著抑制白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎症因子表达，发挥对SiO2诱导的肺纤维化抑制作用［2］；PM2.5［3］和脂多糖（LPS）［4］诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型进一步确证了其对白介素-6（IL-6）、IL-1β和TNF-α等炎症因子的显著抑制活性；其中贝母兰宁、山药素Ⅲ、3’-O-甲基山药素Ⅲ和3-羟基-5-甲氧基联苄等成分是白及发挥抗炎活性的重要功效物种［5-6］，且白及中含量较高［7］。通过进一步系统研究，制备了一个富含上述成分的白及药效部位（EFBS），其对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型和小鼠急性肺损伤模型表现出显著的抗炎活性和肺损伤保护作用［8］。而IL-1β是与OA密切相关的炎症因子，其可刺激软骨细胞分泌IL-6、MMP13等因子，促进蛋白聚糖和II型胶原降解，引发关节炎［9］。因此，本文采用UPLC-QTOFMS对EFBS作进一步成分解析，并通过制备IL-1β诱导的软骨组织和ATDC5细胞炎症模型探讨EFBS是否对骨关节炎具有潜在治疗作用及其可能分子机理。

1 材料与方法

1.1 细胞和动物 小鼠成软骨细胞（ADTC5），上海泽叶生物科技有限公司；雄性ICR小鼠（20±2）g，上海BK公司。

1.2 仪器及试剂 生物组织石蜡包埋机、荧光定量PCR仪和CO2生物培养箱（赛默飞世尔科技公司）；多功能酶标仪（Perkin Elmer公司）；ACQUITY超高效液相色谱和SYNAPT G2-Si Q-TOF 质谱仪（Waters公司）；轮转式切片机（Lecia公司）；白及采自湖北梅川镇，经张春椿副教授鉴定为兰科植物白及Bletilla striata （Thunb.）Rei chb.f.的假鳞茎；BD-CBA小鼠炎症因子检测试剂盒（美国BD公司）；DMEM/F12培养基、胎牛血清（Gibco公司）；ITS诱导剂（Sigma公司）；反转录试剂盒（Takara公司）；引物（COL2A1、MMP13、GAPDH）由上海生工合成；色谱纯乙腈和甲酸（默克公司）；其它试剂均为分析纯。

1.3 方法 （1）EFBS制备和化学成分表征：按照实验室先前建立的方法，制备EFBS［8］。精密称取EFBS并溶解稀释成1.0 mg/mL，过0.22 μm滤膜，进样作UPLC-QTOF-MS分析。色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC Cortecs T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm，Waters），保护柱为Cortecs T3 Van Guard（2.1×50 mm，1.7 μm，Waters）；流动相为A（乙腈）和B（0.1%甲酸溶液）梯度洗脱，即0～36 min，20%～100% A；流速0.30 mL/min，柱温30 ℃，进样量为2 μL。质谱检测条件：SYNAPTG2-SiQ-TOF质谱仪，电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式；脱溶剂气流量为1,000 L/h，脱溶剂气温度为500 ℃；离子源温度120 ℃；锥孔电压：20.0 V；毛细管电压：3.0 kV（+）；采用Waters公司Lockspray校正系统，亮氨酸-脑啡肽（［M+H］+=556.2771，2 ng/mL）为标准物进行在线实时质量校正；质量扫描范围（m/z）：50～1500 Da，扫描时间0.2 s；采用MassLynxV 4.1工作站进行数据采集处理。（2）EFBS对IL-1β诱导的小鼠关节软骨炎症因子和胶原降解抑制作用：①IL-1β诱导的小鼠关节软骨炎症模型建立：ICR小鼠颈椎脱臼处死，70%乙醇消毒，解剖取股骨头软骨；用含双抗的PBS润洗3次，无菌PBS润洗后，转入96孔板（1个/孔），加入200 μL DMEM预培养2 d；更换培养液后加入不同浓度IL-1β刺激4 d（每个处理6个软骨），取上清CBA法测定细胞因子水平。软骨10%中性福尔马林固定48 h，10% EDTA脱钙软化，流水冲洗，常规石蜡包埋切片，番红-固绿染色观察软骨胶原降解情况，确定IL-1β处理浓度。②EFBS药效评价：按上述方法进行软骨培养，不同浓度EFBS预培养2 h，加入IL-1β刺激培养4 d，取上清CBA法测定炎症因子水平，软骨固定、脱钙、切片作番红-固绿染色，分析EFBS抗炎、抑制胶原降解情况。（3）EFBS对IL-1β诱导ADTC5细胞胶原降解抑制作用及分子机制：①EFBS对ADTC5细胞生长影响：取指数生长期ADTC5细胞，DMEM培养基培养，完全铺满瓶底后更换成DF12分化培养基（含1% ITS），每3 d更换1次，诱导分化培养21 d。胰酶消化后用DF12分化培养基调整细胞密度，以5×105个/孔接种96孔板；培养过夜后加入不同浓度EFBS，培养24 h后采用CCK-8法测定细胞存活率。②EFBS对IL-1β诱导ADTC5细胞胶原降解抑制作用：取诱导分化培养21 d的ADTC5细胞，用分化培养基调整细胞密度，以5×105个/孔接种12孔板；培养过夜后加入不同浓度EFBS预培养2 h，加入终浓度为10 ng/mL的IL-1β刺激培养3 d。去上清液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS润洗3次，加1%阿利新蓝染色30 min，PBS润洗3次，拍照分析胶原降解情况［10］。③EFBS对Ⅱ型胶原蛋白α1（COL2A1）和基质金属蛋白酶13（MMP13）基因表达影响：按照上述方法传板，药物预处理和IL-1β刺激培养3 d；去上清液，预冷PBS润洗2次，根据试剂盒说明书操作，Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，荧光定量PCR测定COL2A1和MMP13基因表达情况。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 6统计软件分析处理实验结果，计量资料以（）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EFBS质谱表征 EFBS经UPLC分离QTOF-MS检测，其基峰离子色谱图如图1所示。通过查阅文献建立白及化合物库，MassLynxV 4.1软件搜库比对作初步鉴定，并进一步通过分析各峰保留时间，化合物裂解规律、标准品对照及与文献中相关数据比对分析，共鉴定了12个峰物质，其中菲类和联苄各6个。

图1 EFBS正离子模式的基峰离子色谱图

2.2 EFBS对IL-1β诱导的关节软骨炎症因子分泌和基质降解抑制作用 IL-1β可剂量依赖性促进关节软骨释放IL-6和MCP-1，但20 ng/mL和40 ng/mL无显著性差异（P＞0.05）（图2 A-B）；切片番红-固绿染色结果表明，正常组软骨基质染色均匀呈深红色，5 ng/mL IL-1β刺激切片外缘染色明显变浅呈粉红色，表明胶原基质降解明显；而＞10 ng/mL切片外缘几乎呈白色，但继续增加浓度变化并不明显（P＞0.05）（图2 C）；从文献资料看，大多研究采用10 ng/mL IL-1β刺激［11］，因此，确定该浓度用于后续研究。与模型组比较，EFBS预处理可剂量依赖性抑制IL-1β诱导的IL-6和MCP-1升高（P＜0.05），其中40 μg/mL处理组两个因子抑制率分别达88.736%±19.305%和69.189%±26.366%（图2 D、E）。切片结果表明，EFBS也可剂量依赖性抑制胶原基质降解（图2 F）。

图2 软骨培养上清液中炎症因子水平及软骨切片番红-固绿染色结果。注：A、B中与对照组比较，**P＜0.01；D、E中与模型组比较，**P＜0.01

2.3 EFBS对IL-1β诱导的ATDC5细胞胶原蛋白降解抑制作用 CCK-8结果表明，EFBS在50 μg/mL剂量范围内对ATDC5细胞存活率无显著影响（P＞0.05），但60 μg/mL浓度时相比对照组存活率显著下降（P＜0.05）（图3 A）。10 ng/mL IL-1β处理后，经阿利新蓝染色与对照组相比显著变浅，而20～40 μg/mL浓度范围内随EFBS剂量增加染色明显加深，表明EFBS对IL-1β诱导的胶原蛋白降解具有较好的抑制作用（图3 B）。

图3 EFBS对ATDC5细胞存活率影响及对IL-1β诱导的ATDC5细胞基质降解抑制作用。注：A. 细胞存活率，与对照组比较，**P＜0.01；B. ATDC5细胞基质阿利新蓝染色

2.4 EFBS对COL2A1和MMP13基因表达影响 荧光定量PCR结果表明IL-1β诱导可显著下调COL2A1基因表达，同时促进MMP13基因表达（P＜0.05）；EFBS可剂量依赖性上调COL2A1基因mRNA水平，尤其40 μg/mL处理组甚至超过正常对照组（P＜0.05）（图4 A）；虽然相比模型组EFBS各剂量组MMP13基因表达水平均显著降低（P＜0.05），但并不呈剂量关系，30 μg/mL表达量最低，而40 μg/mL处理组又有所升高，但与正常组相当（图4B）。

图4 EFBS对COL2A1和MMP13基因表达影响。注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3 讨论

HPLC分析表明贝母兰宁、山药素Ⅲ、3’-O-甲基山药素Ⅲ和3-羟基-5-甲氧基联苄四个成分含量＞50%［8］，但其余成分尚不清楚；本研究通过UPLCQTOF-MS进一步对EFBS化合物组成进行了表征。结果共鉴定了12个峰，菲类和联苄类是其主要成分，这为进一步制备成分基本清楚、含量相对稳定、疗效确切的白及药物制剂奠定了良好基础。

OA的发生、发展与多种因素有关，多是由于关节局部损伤、炎症、长期慢性劳损或软骨组织新陈代谢失衡造成［12］，但确切机制不完全清楚。药物注射诱导、关节制动或撞击和手术方法等建立的各种关节炎模型为阐明OA发病机制和药效评价奠定了良好基础［13］。但动物模型周期较长，成本高，也不利于高通量筛选，在这方面体外组织、细胞模型具有独特优势，同时也是对体内模型的重要补充［14］。软骨组织对于关节功能的发挥至关重要，当关节软骨损伤后，力的吸收作用降低，关节损伤、退变会进行性加重。软骨细胞是关节软骨中唯一存在的细胞，其功能失调与骨关节炎发生、发展密切相关。大量研究表明，关节炎患者关节腔内IL-1β水平异常升高，其可诱导软骨细胞分泌IL-6、MMP13等因子，从而导致关节软骨基质降解，软骨细胞凋亡，最终形成关节炎［15］。因此，本研究首先采用IL-1β诱导的关节软骨炎症模型，从组织水平探究白及EFBS对其保护作用；结果表明，EFBS可剂量依赖性抑制IL-1β诱导的IL-6和MCP-1炎症因子分泌和软骨基质降解。进一步采用IL-1β诱导的ATDC5软骨细胞模型进行验证，结果表明EFBS在20～40 μg/mL范围内也可剂量依赖性抑制胶原基质降解。

IL-1β可通过诱导MMPs，尤其MMP13促进II型胶原蛋白降解，同时其也可抑制II型胶原蛋白合成进一步加剧软骨基质降解［16］；因此，本研究采用荧光定量PCR技术对COL2A1和MMP13基因表达情况进行了初步分析。结果表明，IL-1β刺激显著上调MMP13 mRNA水平，并抑制COL2A1基因表达从而减少胶原沉积，使得阿利新蓝染色变浅；而EFBS处理可剂量依赖性增加COL2A1 mRNA水平，同时显著抑制MMP13基因表达，使得阿利新蓝染色加深。可见，EFBS可抑制炎症因子的分泌和MMP13的表达，同时促进II型胶原蛋白合成等多个方面抑制软骨基质的降解；结果表明EFBS在治疗OA疾病方面具有潜在应用价值，值得进一步深入系统研究。