温度对小鼠海马神经元细胞存活素基因表达及细胞活力影响的初步研究

朱 磊,曾 亮,李 芳

在职业病的众多危害因素中,高温作为十分常见的一种,已被很多文献报道,根据相关文献的描述,长期处于高温的环境下,人的认知能力及记忆力受到影响,而表现出不同程度的下降[1]。已知在大脑的边缘系统中,有与认知功能有着密切关系的海马,其作为边缘系统非常重要的组成部分,对记忆功能和学习能力也有着很重要的影响[2]。存活素(SVV)基因,作为凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员之一,它不仅具有抑制细胞凋亡的作用,同时还具有调节细胞分裂的功能。有相关研究表明,SVV基因作为一种抗凋亡基因,它的表达与肿瘤、颅脑外伤[3]、缺血再灌注损伤[4]、中枢神经系统疾病及相关并发症[5]等的发生密切相关。目前,关于SVV基因与高温引起神经系统损伤的相关研究,还鲜有报道。本研究旨在通过观察在不同的干预温度下,尤其是高温状态下,神经元细胞中SVV基因的表达水平及神经元细胞的细胞活力是否会受影响,为后续深入研究SVV基因与外界温度变化,尤其是高温对大脑神经元细胞功能的影响提供一些依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料:小鼠海马神经元细胞系(HT22),由宁夏医科大学生物化学与分子生物学系实验室保存。

1.2 试剂及仪器:DMEM培养基购自Gibco;胎牛血清(FBS)购自BI;Survivin Polyclonal antibody(10508-1-AP)购自Proteintech;Mouse Anti-β-Actin mAb(TA-09)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZB-2301)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)购自北京中杉金桥科技有限公司;全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒、CCK-8法细胞增殖检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;反转录试剂盒及qPCR试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司。

1.3 细胞培养及分组:将培养好的小鼠海马神经元细胞随机分为4组,对照组在37 ℃、5% CO2下培养,3个实验组分别在33 ℃、39 ℃、41 ℃,5% CO2下培养,各组分别培养3 h、6 h、12 h、24 h。

1.4 Western blot检测HT22细胞中SVV基因的蛋白表达水平:将HT22细胞的培养基吸去,加入PBS洗3次,每次5 min。加入胰酶消化细胞30 s,加入10%血清培养基终止消化,收集消化后的HT22细胞,移入离心管,使用离心机(1 000 r/min)离心5 min,吸去上清液,加入裂解液,充分震荡使细胞裂解破碎。使用离心机(12 000 r/min)在4 ℃条件下离心5 min,后吸取上清蛋白液。使用BCA法检测上清蛋白液的蛋白浓度,将蛋白液、ddH2O和5×上样缓冲液混合后配成 30 μg/μL的蛋白工作液,在100 ℃下变性5 min。配制15%分离胶和5%浓缩胶的电泳凝胶,每孔上样体积为25 μL;先在恒压80 V条件下电泳30 min,再在恒压120 V条件下电泳90 min;后恒流200 mA转膜3 h,用5%脱脂牛奶封闭1 h;加入一抗β-Actin(稀释比例为1∶1 500)、SVV基因(稀释比例为1∶500),室温下摇床孵育1 h,4 ℃静置过夜;第2 d 取出,摇床复温1 h,吸去一抗,用1×TBST洗膜3次,5 min/次;加入二抗(稀释比例为1∶8 000),摇床孵育1 h,吸去二抗,用1×TBST洗膜3次,5 min/次;加入发光液,曝光,获得目的蛋白条带及内参条带。通过应用Image J图像分析系统测定各目标蛋白条带的灰度值,以β-actin为内参,结果使用目的蛋白与β-actin的灰度比值进行表示,计算出SVV基因的相对蛋白表达量。

1.5 Real-time PCR检测SVV基因的mRNA表达水平:将HT22细胞的培养基吸去,加入PBS洗3次,每次5 min。通过Trizol法收集并提取HT22细胞的总RNA。根据全式金试剂盒(AU341-02)说明,将提取的总RNA反转录成cDNA,根据目的基因及内参基因的样本数,配制PCR反应液,以每管13 μL分装,每管再加入2 μL样本;设置程序进行Real-time PCR反应,反应条件设置为95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s,40个循环;内参设置为GAPDH。扩增完毕后根据熔解曲线进行分析,结合内参,按照公式(2-ΔΔCT 法分析)进行计算,每份样本均设置3个复孔进行检测,结果取其平均值。引物序列详见表1。

表1 引物序列

1.6 CCK-8检测HT22细胞活力:加HT22细胞悬液每孔100 μL(1×104个细胞)到96孔板中(不同温度、不同时间点均设置4个副孔),置于培养箱,设置37 ℃,5% CO2孵育过夜;分别置于33 ℃、37 ℃、39 ℃及41 ℃的培养箱中,以5% CO2分别培养12 h、24 h,达到干预时间后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在37 ℃,5% CO2的条件下孵育1 h。用酶标仪测定在450 nm处各孔的吸光值(OD值),取各孔OD值平均数,计算细胞活力。

2 结果

2.1 温度变化对HT22细胞中SVV基因的蛋白表达水平的影响:Western blot结果显示,与37 ℃对照组比较,39 ℃实验组及41 ℃实验组中SVV基因的蛋白表达水平在不同时间点表现出了不同程度的升高(P<0.05),其中以12 h和24 h升高较为明显;但33 ℃实验组的蛋白表达水平未见明显变化,见图1(封二)。

2.2 温度变化对HT22细胞中SVV的mRNA表达水平的影响:Real-time PCR结果显示,39 ℃实验组及41 ℃实验组中SVV基因的mRNA表达水平较37 ℃对照组明显升高(P<0.05),而33 ℃实验组的mRNA表达水平在不同时间点略有升高(P<0.05)或升高不明显,见图2(封二)。

2.3 温度变化对HT22细胞活力的影响:CCK-8结果显示,与37 ℃对照组相比较,33 ℃实验组、39 ℃实验组以及41 ℃实验组中,细胞活力在12 h及24 h表现出了不同程度的下降(P<0.05),其中以33 ℃下降较为明显,可见亚低温对细胞活力的抑制作用较为明显,见图3(目次后)。

3 讨论

SVV基因是凋亡抑制蛋白家族的成员之一,是在1997年由耶鲁大学的Altierii等通过使用效应细胞蛋白酶受体1(EPR1)cDNA进行杂交,并在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来的[6]。SVV基因可以同时作用于内源性和外源性两条凋亡信号通路发挥抗凋亡作用。一方面,它可以直接作用于caspase-3,通过抑制caspase-3的活性,来阻断细胞的凋亡过程[7]。另一方面,它还可以通过作用于细胞周期调控因子CDK4,与其形成SVV-CDK4复合物,使得p21能够从CDK4复合物中释放出来并与caspase-3结合,从而间接地抑制caspase通路而阻断细胞凋亡[8]。SVV基因几乎在所有的人类恶性肿瘤,如在胰腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤中呈现出高度选择性表达[9],但是在除淋巴细胞、胸腺、多核粒细胞、血管内皮细胞及原始造血细胞外的多数正常组织中几乎不表达[10]。

在神经系统研究领域,有相关研究发现在颅脑损伤后,星形胶质细胞及神经元细胞中的SVV基因大量表达[11],SVV基因的上调可以减轻DNA的裂解及细胞的死亡[12];脑缺血再灌注后的缺血侧脑组织中SVV基因的表达水平升高,于再灌注3 h后,出现SVV基因阳性神经元,其参与了抑制脑缺血再灌注损伤后神经元细胞的凋亡[13];在缺血性卒中后,SVV基因也呈现出了高表达[14],其作为一种抗凋亡保护基因,在卒中后参与了脑内新生血管的形成[15]。近年来,在临床诊疗过程中,因为幼儿高热惊厥,以及持续的高热状态造成儿童大脑损伤时有发生。上述关于SVV基因与多种神经系统疾病及颅脑损伤的相关研究为开展研究不同温度变化,尤其是高温,对神经元细胞中SVV基因的表达情况及细胞功能的影响提供了一定的参考。

本研究通过对HT22细胞进行了不同培养温度的处理,观察了不同温度变化尤其是高温条件对神经元细胞活力的影响,以及细胞中SVV基因的表达水平的变化。通过研究可知,3个实验组的温度变化使细胞活力较对照组有所下降,其中33 ℃实验组的抑制作用较为明显,39 ℃实验组和41 ℃实验组细胞活力下降程度较33 ℃实验组弱一些,由此可知,低温对细胞活力的抑制作用较高温更强一些,同时,该现象可能也与SVV基因表达水平升高,对细胞起到了保护作用有关。

Western blot和Real-time PCR的结果表明:39 ℃、41 ℃两个实验组中SVV基因的蛋白表达水平及mRNA表达水平较37 ℃对照组均有所升高,其中以41 ℃实验组升高最为明显,说明对神经元细胞进行不同温度变化(尤其是高温)的处理时,SVV基因作为一种抗凋亡保护基因,其表达水平升高,以抵抗细胞凋亡,33 ℃实验组中SVV基因的蛋白表达水平及mRNA表达水平较37 ℃对照组轻度升高或升高不明显,推测其可能是与亚低温(33 ℃)本身对细胞的抑制作用有关。

根据上述结论可以进行进一步推断,即在一定的温度范围内,低温对于神经元细胞的细胞功能所产生的影响主要体现在其有着较强的抑制作用,而高温对神经元细胞的细胞功能产生的影响则更多体现在引起或加快细胞凋亡或坏死,在所得研究结果中,细胞活力检测实验中33 ℃实验组细胞活力下降较为明显,Western blot实验中39℃实验组和41℃实验组中SVV基因的蛋白表达水平升高较明显可以为这一推断提供一些依据。同时,本研究结果也可为后续继续深入研究高温对神经元细胞及大脑功能影响机制的研究提供参考。