芝麻素影响冠心病大鼠心肌细胞凋亡的机制

魏鹏辉,刘 英,程敏菊

1.华北医疗集团峰峰总医院心内科,邯郸 056000;2.唐山开滦医院心血管内科,唐山 065000;3.邢台市人民医院心脏内科,邢台 054000

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病,coronary heart disease, CHD)是冠状动脉功能性/器质性病变,即冠状动脉血管发生粥样硬化,引起冠状动脉供血与心肌需求失衡,心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病[1]。CHD的临床表现为心力衰竭、心悸乏力,甚至猝死,极大威胁人们的生命健康[2]。芝麻素是一种天然抗氧化剂,作为芝麻的主要活性成分,具有降低三酰甘油(triglyceride, TG)、胆固醇(cholesterin, TC)及改善心肌及血管肥厚、减少中风等功效[3]。脂代谢异常、血管内皮功能异常是CHD的主要诱因[4]。研究表明,芝麻素可通过降低炎症因子释放抑制CHD大鼠心肌细胞的异常活化[5]。因此,本研究建立CHD模型,研究芝麻素对CHD大鼠脂代谢、血管内皮功能、心肌组织的影响及作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HM355S全自动轮转式石蜡切片机(德国MICON医疗技术有限公司);DxC700AU全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司);PowerPac电泳仪和CheniDoc XRS化学发光成像分析系统,均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 试药

芝麻素(质量分数>98%,批号Z-001,成都瑞芬思生物科技有限公司);羧甲基纤维素钠(批号C9481)、BCA蛋白定量分析试剂盒(批号BCA1),均购自美国Sigma-Aldrich公司;一氧化氮Assay试剂盒(批号ab272517,美国Abcam公司);白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELISA试剂盒(批号:SEKR-0005、SEKR-0009),均购自北京索莱宝生物科技有限公司;兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)抗体(批号ab154598)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase, Akt)抗体(批号ab154598)、p-Akt抗体(批号ab8805)、一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)抗体(批号ab38449)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase-12, Caspase-12)抗体(批号ab199956),细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)抗体(批号ab62484)及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G(批号ab282575),均购自美国Abcam公司;p-eNOS抗体[批号YS-(kt)-0416,上海研生实业有限公司]。

1.3 动物

80只SPF级雄性SD大鼠,10周龄,体质量为(200±20) g,购自武汉云克隆动物有限公司,许可证号SCXK(鄂)2018-0021,室温饲养,实验前适应性饲养7 d。

2 方法

2.1 大鼠模型的建立

适应性饲养后取64只大鼠给予高脂饲料饲养,建立CHD模型[6]:以质量分数3%胆固醇、10%白糖、20%猪油、15%酪蛋白、1%维生素D及51%基础饲料连续喂养4周。末次喂养后禁食12 h,不禁饮,30 mg·kg-1戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉大鼠,尾静脉注射垂体后叶素30 u·kg-1。记录Ⅱ导联心电图,Ⅱ导联心电图中测定J点位移>0.1 mV即建模成功[5]。

2.2 干预方法

将建模成功大鼠随机分为模型组及芝麻素低剂量、中剂量和高剂量组,每组16只,剩余16只为对照组。芝麻素低剂量、中剂量和高剂量组按照每天2 mL,分别灌胃40、80、160 mg·kg-1芝麻素(羧甲基纤维素钠溶液溶解),对照组和模型组每天灌胃羧甲基纤维素钠溶液2 mL,连续干预28 d。

2.3 检测脂代谢相关指标

大鼠干预结束后禁食12 h,各组大鼠尾静脉取血5 mL,以3 000 r·min-1(离心半径为25 cm)离心10 min,收集血清,用全自动生化分析仪检测TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。

2.4 检测血管内皮功能相关指标

用30 mg·kg-1戊巴比妥麻醉各组大鼠后,迅速取出大鼠胸主动脉,清除结缔组织,将血管剪成3～4 mm血管环,悬挂于连接张力换能器的K-H液的气管浴管中,浴管中供给气体(体积分数95%氧气和体积分数5%二氧化碳)。待血管环稳定后滴注1 μmol·L-1去氧肾上腺素干预。待张力恢复至1 g,再给予1 μmol·L-1去氧肾上腺素收缩血管,达峰值10 min后,连续给予乙酰胆碱(acetylcholine, ACH),稳定后血管环平衡至基础张力。血管收缩达峰值后,累积给药,给予酸化亚硝酸钠,以1 μmol·L-1的去氧肾上腺素诱发最大收缩幅度,记录血管张力变化。

2.5 HE染色观察组织学变化

取各组8只大鼠左心室心肌组织,用100 g·L-1多聚甲醛固定48 h,乙醇脱水,石蜡包埋,制成厚4 μm的切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,苏木精染色5 min,伊红染色5 min,脱水固定后,中性树脂封片,镜下观察并拍照记录。

2.6 检测IL-6、TNF-α和一氧化氮(nitric oxide,NO)水平

无菌取剩余各组的8只大鼠心肌组织,液氮处理后置于-80 ℃的冰箱中保存,取心肌组织50 mg,加入PBS 1 mL匀浆,以3 500 r·min-1低温离心10 min(离心半径为10 cm),取上清,设置对照品孔、样本孔及空白孔,将稀释样品及对照品液加入相应检测孔内,抗体包被,洗板,加入酶结合物工作液,洗板,加入显色工作液,终止反应,于450 nm波长处测定各孔吸光度(A)值,绘制对照品线性回归曲线,计算样品中IL-6、TNF-α和NO水平。

2.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

取各组2.6项下冷冻保存的大鼠心肌组织研磨,制备单细胞悬液(5×105个·mL-1),取悬液100 μL,加入稀释好的1×Annexin V Binding Buffer 100 μL,用移液枪缓慢吸打混匀,避光静置10 min,加入FITC-Annexin V和PI染液5 μL,吸打混匀,避光静置10 min,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.8 检测PI3K等蛋白水平

取各组2.6项下冷冻保存的大鼠心肌组织100 mg,置于无酶EP管中,加入RIPA 0.6 mL,充分匀浆,以12 000 r·min-14 ℃离心10 min,取上清,BCA法检测蛋白质量浓度,SDS-PAGE电泳,湿转蛋白至PVDF膜上,用50 g·L-1脱脂牛奶封闭2 h,于一抗(TBST行1∶1 000稀释)中4 ℃孵育过夜,TBST洗膜20 min,加入二抗(TBST行1∶8 000稀释),置于摇床中振荡孵育1 h,TBST洗膜20 min,将PVDF膜置于凝胶成像仪显影区,均匀滴加显影液,于暗室中进行曝光、显影,Image J软件分析,目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 脂代谢指标的比较

模型组的TC、TG较对照组升高,HDL-C较对照组降低(P<0.05);芝麻素各剂量组的TC、TG较模型组降低,HDL-C较模型组升高(P<0.05);TC、TG与芝麻素呈剂量依赖性降低,HDL-C与芝麻素呈剂量依赖性升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脂代谢的比较

3.2 血管内皮功能的比较

模型组ACH处理血管最大舒张程度较对照组升高(P<0.05);芝麻素各剂量组ACH处理血管最大舒张程度较模型组降低(P<0.05);ACH处理血管最大舒张程度与芝麻素呈剂量依赖性降低(P<0.05)。酸化亚硝酸钠处理血管最大舒张程度各组间差异比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血管内皮功能的比较

3.3 组织形态学的比较

对照组大鼠心肌纤维结构清晰,排列规则紧密,细胞质和细胞核染色均匀。模型组大鼠心肌细胞染色不均,间质伴有炎症细胞浸润,心肌纤维排列紊乱,或见断裂。芝麻素各剂量组大鼠心肌细胞排列较模型组整齐规则,炎症细胞浸润减少,心肌组织的损伤较模型组减轻。见图1。

注:A.对照组;B.模型组;C.芝麻素低剂量组;D.芝麻素中剂量组;E.芝麻素高剂量组。

3.4 心肌组织IL-6、TNF-α和NO水平的比较

模型组IL-6、TNF-α水平较对照组升高,NO水平较对照组降低(P<0.05);芝麻素各剂量组IL-6、TNF-α水平较模型组降低,NO水平较模型组升高(P<0.05);IL-6、TNF-α水平与芝麻素呈剂量依赖性降低,NO水平与芝麻素呈剂量依赖性升高(P<0.05)。见表3。

表3 心肌组织IL-6、TNF-α和NO水平的比较

3.5 心肌组织凋亡率的比较

模型组心肌组织凋亡率较对照组升高(P<0.05);芝麻素各剂量组心肌组织凋亡率较模型组降低(P<0.05);心肌组织凋亡率与芝麻素呈剂量依赖性降低(P<0.05)。见表4、图2。

注:A.对照组;B.模型组;C.芝麻素低剂量组;D.芝麻素中剂量组;E.芝麻素高剂量组。

表4 心肌组织凋亡率的比较

3.6 心肌组织诸项蛋白水平的比较

模型组Caspase-12、ICAM-1蛋白水平较对照组升高,PI3K、p-Akt和p-eNOS蛋白水平较对照组降低(P<0.05);芝麻素各剂量组Caspase-12、ICAM-1蛋白水平较模型组降低,呈剂量依赖性降低(P<0.05);PI3K、p-Akt和p-eNOS蛋白水平较模型组升高,呈剂量依赖性升高(P<0.05)。见表5、图3。

注:A.对照组;B.模型组;C.芝麻素低剂量组;D.芝麻素中剂量组;E.芝麻素高剂量组。

表5 心肌组织PI3K、p-Akt、p-eNOS、Caspase-12和ICAM-1蛋白水平的比较

4 讨论

CHD是临床上较为常见的一种心血管疾病,随着生活水平变化CHD呈年轻化趋势[7]。CHD患者会伴随出现不同程度的血脂功能异常[8]和血管内皮功能损伤[9]。有研究发现芝麻素和异芝麻素混合物可改善高脂饮食大鼠的脂质代谢[10]。另有研究发现,芝麻素联合维生素E对由D-半乳糖和三氯化铝诱导的大鼠主动脉内皮功能障碍具有明显的改善作用[11]。本研究以高脂喂养建立CHD大鼠模型,深入探讨芝麻素对CHD大鼠心肌组织的作用及可能的作用机制。

本研究中,HE染色结果显示芝麻素各剂量组大鼠心肌细胞排列较模型组更整齐规则,炎症细胞浸润减少,心肌组织的损伤较模型组减轻,且芝麻素各剂量组TC、TG和ACH诱导血管舒张效应较模型组降低,HDL-C较模型组升高,表明芝麻素可有效抑制胆固醇合成,降低血脂水平,并缓解主动脉ACH处理血管最大舒张程度,保护心肌组织,发挥治疗CHD的作用。炎症反应对CHD的发生和发展有显著影响,IL-6、TNF-α水平在一定程度上可反映动脉粥样硬化的程度[12],有研究发现抑制炎症反应可保护血管内皮细胞,提高血管内皮功能,保护心肌细胞[13]。ICAM-1是炎性细胞参与动脉粥样硬化形成的必要条件,也参与血管内皮损伤过程[14]。Caspase-12是Caspase蛋白家族中参与细胞凋亡的主要蛋白,有研究发现下调Caspase-12可发挥抑制心肌组织凋亡的作用[15]。本研究中芝麻素各剂量组IL-6、TNF-α、ICAM-1和Caspase-12水平较模型组降低,表明芝麻素可以减轻CHD大鼠炎症反应和血管内皮损伤,抑制凋亡蛋白分泌,保护心肌组织。

PI3K/Akt作为抗凋亡的主要调控信号通路,在CHD中发挥作用[16]。PI3K可使下游靶因子Akt磷酸化[17],活化的Akt进一步激活下游靶蛋白eNOS[18]。eNOS磷酸化后可催化NO的生成,NO能调节血流分布和血管张力,保护血管内皮功能[19],也可以通过抑制mPTP通道开放而发挥抑制凋亡的作用[20]。本研究中芝麻素各剂量组心肌组织凋亡率较模型组降低,NO、PI3K、p-Akt和p-eNOS较模型组升高,表明芝麻素可抑制CHD大鼠心肌细胞凋亡,增加NO合成量,从而保护心肌组织,其可能与激活PI3K-Akt-eNOS信号通路有关。

综上所述,芝麻素可有效改善CHD大鼠脂代谢水平和血管内皮功能损伤,减轻心肌组织炎症反应,降低ICAM-1、Caspase-12蛋白的表达水平,抑制心肌细胞凋亡,保护心肌组织,可能与调控PI3K-Akt-eNOS信号通路的相关蛋白有关。