白花蛇舌草降低胃癌细胞化疗耐药的机制

王 辉 ,张纯宣 ,田 林 ,蒋新猛 ,柴 杰

1.聊城市传染病医院普外科,聊城 252000;2.山东省肿瘤防治研究所省医科院,济南 250000

胃癌是临床常见的消化道癌症,可并发幽门梗阻及消化道出血,造成头晕、呕吐,癌肿穿孔后会形成胃肠瘘及急性弥漫性腹膜炎[1-2]。根治性切除术是胃癌的首选治疗手段,早中期患者预后良好,对于进展期及晚期患者,以顺铂为主的化疗仍是最有效的治疗方式,但耐药会严重影响治疗效果[3]。白花蛇舌草是我国常见的1年生草本中草药,具有抗炎、抗氧化、抗蛇毒及增强机体免疫力等多种生物学活性,研究发现,白花蛇舌草可使细胞增殖周期停滞,抑制人胃癌细胞增殖,从而发挥抗肿瘤活性[4]。本研究通过建立人胃癌SGC-7901细胞顺铂耐药模型,研究白花蛇舌草对其化疗耐药的影响及相关机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司);Infinite M1000酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 试药

白花蛇舌草注射液(规格为2 mL,修正药业集团长春高新制药有限公司);顺铂注射液(规格为20 mg,南京制药厂有限公司);信号转导及转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/神经源性基因Notch同源蛋白1(neurogeic gene Notch homo-log 1,Notch 1)轴激活剂Jagged1蛋白(上海户实医药科技有限公司);四甲基偶氮唑盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]试剂盒、荧光标记2-脱氧葡萄糖{2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose,2-NBDG}检测试剂盒、乳酸检测试剂盒,均购自上海抚生实业有限公司;膜连蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)细胞凋亡试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司];电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)液试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);兔抗人STAT3、Notch1一抗,均购自日本MBL公司。

1.3 细胞系

人胃癌SGC-7901细胞系,购自中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养

将人胃癌SGC-7901细胞培养于RPMI1640培养基(含胎牛血清、青霉素100 u·mL-1、链霉素0.1 mg·mL-1),在37 ℃体积分数5%二氧化碳环境下培养,待其稳定传代,每组设置5个复孔,取对数期细胞进行后续实验。

2.2 建立SGC-7901细胞顺铂耐药模型

取对数期SGC-7901细胞置于完全培养基,用质量浓度递增法体外诱导,更换不同质量浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 μg·mL-1)顺铂溶液,每天剔除死亡细胞继续传代,持续1周,待细胞可稳定存活,表明耐药性诱导成功。

2.3 MTT法检测耐药细胞的增殖抑制率

取对数期SGC-7901及SGC-7901耐药细胞,置于RPMI1640培养基(分别含顺铂2、4、8、16、32 μg·mL-1)中培养48 h,孔内加入5.00 g·L-1MTT溶液20 μL,静置2 h,弃上清,加入DMSO溶液150 μL,摇床振荡,用酶标仪检测490 nm处的吸光度值(A),计算二者的增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=[(1-各质量浓度A值/对照孔A值)]×100%,绘制标准曲线,计算半数抑制浓度(IC50)。

2.4 细胞分组及干预

取对数期SGC-7901耐药细胞,用PBS洗涤,用胰酶消化重悬,以1×106个·mL-1接种至6孔板,待细胞融合贴壁,随机分为耐药组、白花蛇舌草组、激活剂组、联合组。耐药组不处理,白花蛇舌草组加入白花蛇舌草注射液(50 μg·mL-1终质量浓度),激活剂组加入Jagged1蛋白(500 ng·mL-1),联合组加入白花蛇舌草注射液(50 μg·mL-1)与Jagged1蛋白(500 ng·mL-1)[5-6]。干预48 h后进行后续实验。

2.5 MTT法检测顺铂对细胞的增殖抑制率

取干预处理后的各组细胞,同2.3操作,计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=[(1-各质量浓度A值/对照孔A值)×100%。绘制标准A曲线,计算IC50。

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

取干预处理后的各组细胞,用PBS洗涤,用胰酶消化重悬,以1×106个·mL-1接种至6孔板,用RPMI1640培养液(含顺铂8 μg·mL-1)培养48 h,用PBS洗涤,冰上离心8 min(3 000 r·min-1,离心半径为10 cm),binding buffer液标记细胞,再加入AnnexinV-FITC、PI各5 μL,二次染色,遮光保存20 min,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,并计算凋亡率。

2.7 细胞葡萄糖摄取率的检测

取干预处理后的各组细胞,用PBS洗涤,用胰酶消化重悬,以1×106个·mL-1接种至24孔板,24 h后加入2-NBDG(100 μmol·L-1)继续培养1 h,用PBS洗涤,用胰酶消化重悬,PI染色,用流式细胞仪检测2-NBDG荧光表达量,计算相对葡萄糖摄取率。相对葡萄糖摄取率(%)=(各组2-NBDG荧光表达量/耐药组2-NBDG荧光表达量)×100%。

2.8 细胞乳酸含量的检测

取干预处理后的各组细胞,用PBS洗涤,用胰酶消化重悬,以1×106个·mL-1接种至24孔板,24 h后加入RIPA裂解细胞,冰上离心10 min(10 000 r·min-1,离心半径为12 cm),取上清,用试剂盒检测乳酸含量。蒸馏水调零后测定530 nm处的A值。计算细胞乳酸含量。细胞乳酸含量=(各组吸光度值-空白吸光度值)/(对照品A值-空白A值)×对照品质量浓度×稀释比例。计算各组相对乳酸含量,细胞相对乳酸含量=各组细胞乳酸含量/耐药组细胞乳酸含量。

2.9 蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞蛋白表达量

取干预处理后的各组细胞,用RIPA裂解细胞并移至离心管内,冰上离心10 min(10 000 r·min-1,离心半径为12 cm),用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定总蛋白并定量。取40 μg待测样本,混合4倍体积上样缓冲液,金属浴变性蛋白,同法离心,取上清,电压80 V行凝胶电泳分离,转至PVFD膜,用BSA封闭液封闭2 h,加入兔抗人STAT3、Notch1一抗(1∶500),置于4 ℃冰箱中冷藏过夜,TBST洗膜,加入二抗(1∶2 000),摇床孵育2 h,TBST洗膜,浸入ECL液发光,暗室显影,凝胶成像分析仪扫描分析条带灰度值,计算细胞蛋白表达量。STAT3、Notch1蛋白表达量=Notch1、STAT3蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。

2.10 统计学方法

数据的分析、处理用统计学软件SPSS 19.0,以(x±s)表示计量资料,以单因素方差分析比较多样本资料,两两样本资料比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 顺铂对耐药细胞的增殖抑制率及IC50值影响的比较

多质量浓度顺铂对SGC-7901、SGC-7901耐药细胞的增殖抑制率及IC50值细胞间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);不同质量浓度顺铂对SGC-7901耐药细胞的增殖抑制率高于SGC-7901细胞,IC50值低于SGC-7901细胞(P<0.05)。见表1。

表1 多质量浓度顺铂对耐药细胞增殖抑制率的比较(x±s,n=5)

顺铂对SGC-7901细胞的IC50为(5.98±1.14) μg·mL-1,对SGC-7901耐药细胞的IC50为(13.44±2.61) μg·mL-1,差异有统计学意义(P<0.05)。

3.2 顺铂对细胞的增殖抑制率及IC50值影响的比较

与耐药组比较,白花蛇舌草组各质量浓度细胞增殖抑制率升高,IC50降低,激活剂组细胞增殖抑制率均降低,IC50升高(P<0.05);与白花蛇舌草组比较,联合组细胞增殖抑制率降低,IC50升高(P<0.05);与激活剂组比较,联合组细胞增殖抑制率升高,IC50降低(P<0.05)。见表2。耐药组、白花蛇舌草组、激活剂组及联合组IC50值分别为(15.98±3.51)、(3.14±0.42)、(29.98±4.01)、(6.71±0.85) μg·mL-1,白花蛇舌草组低于耐药组,激活剂组高于耐药组(P<0.05),而联合组高于白花蛇舌草组,低于激活剂组(P<0.05)。

表2 多质量浓度顺铂对各组细胞增殖抑制率的比较(x±s,n=5)

3.3 各组细胞凋亡率的比较

与耐药组比较,白花蛇舌草组的凋亡率升高(P<0.05),激活剂组降低(P<0.05);与白花蛇舌草组比较,联合组的凋亡率降低(P<0.05);与激活剂组比较,联合组的凋亡率升高(P<0.05)。见表3、图1。

注:A.耐药组;B.白花蛇舌草组;C.激活剂组;D.联合组。

表3 各组细胞凋亡率的比较

3.4 各组细胞葡萄糖摄取率的比较

与耐药组比较,白花蛇舌草组的葡萄糖摄取率降低(P<0.05),激活剂组的葡萄糖摄取率升高(P<0.05);与白花蛇舌草组比较,联合组的葡萄糖摄取率升高(P<0.05);与激活剂组比较,联合组的葡萄糖摄取率降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞葡萄糖摄取率的比较 (x±s,n=5)

3.5 各组细胞相对乳酸含量的比较

与耐药组比较,白花蛇舌草组的相对乳酸含量降低(P<0.05),激活剂组的相对乳酸含量升高(P<0.05);与白花蛇舌草组比较,联合组的相对乳酸含量升高(P<0.05);与激活剂组比较,联合组的相对乳酸含量降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组细胞相对乳酸含量的比较

3.6 各组细胞STAT3、Notch1蛋白表达水平的比较

与耐药组比较,白花蛇舌草组STAT3、Notch1蛋白的表达水平降低(P<0.05),激活剂组STAT3、Notch1蛋白的表达水平升高(P<0.05);与白花蛇舌草组比较,联合组STAT3、Notch1蛋白的表达水平升高(P<0.05);与激活剂组比较,联合组STAT3、Notch1蛋白的表达水平降低(P<0.05)。见表6、图2。

注:A.耐药组;B.白花蛇舌草组;C.激活剂组;D.联合组。

表6 各组细胞STAT3、Notch1蛋白的表达水平的比较

4 讨论

不良饮食习惯是胃癌的主要危险因素,食用高盐食物、熏制品、发霉食物均会诱发胃癌,幽门螺旋杆菌感染、慢性胃部疾病亦是其发病诱因[7-8]。由于我国胃镜筛查覆盖率低、检查过程引起患者不适及患者对早期症状不重视等因素,多数患者临床确诊时已分期较晚,仅能用化疗治疗,但癌细胞可提升自身顺铂耐受、修复自身DNA损伤,使一线顺铂方案失败,极大降低治疗效果[9-10]。因此,探寻提高胃癌细胞顺铂敏感性的辅助新药物是治疗胃癌的关键。

糖酵解是肿瘤细胞常见的代谢方式,可将细胞膜上的葡萄糖转运至细胞内分解并产生乳酸,从而获得更多能量,其强度与肿瘤生长及转移情况密切相关[11]。中医对胃癌认识已久,根据症候特点将其归为“胃脘痛、伏梁、噎膈、积聚”等范畴,乃本虚标实之证,其主要病机为饮食无度、胃寒脾弱、正气不足、寒气蓄积、胃失和降、脾虚不运,以致气机失常、血瘀不散、邪积热毒,日久发为积聚,顺铂乃攻伐之药,虽可抑癌,但亦加剧脾胃损伤,故配合化疗用药应以养胃健脾、清热解毒、活血通络为主[12-13]。白花蛇舌草又称蛇总管,是茜草科植物白花蛇舌草的全草,性凉,味微苦、微甘,归胃经、大肠经、小肠经,可解毒、活血、止痛,治毒蛇咬伤、肠炎、癌肿[14]。白花蛇舌草含有黄酮类、蒽醌类、萜类等多种抗癌物质,有研究结果显示,其可调控血清炎症因子,降低癌细胞的活力与抗性,抑制异种移植结直肠癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡,表明白花蛇舌草可作为消化系统恶性肿瘤潜在增敏及治疗药物[15]。本研究结果显示,与耐药组比较,白花蛇舌草组各质量浓度细胞增殖抑制率、细胞凋亡率升高,IC50、葡萄糖摄取率、相对乳酸含量降低,表明白花蛇舌草可降低胃癌细胞顺铂耐药、促进胃癌细胞凋亡、减弱胃癌细胞糖酵解。

STAT3是在机体细胞内广泛存在的一种DNA结合蛋白,可与相应因子受体结合形成聚合体,参与下游效应因子转录[16-17]。Notch通路是细胞自我更新的重要信号通路,在细胞增殖、凋亡、分化等过程中扮演着重要角色,其中Notch1受体与其配体结合后,在酶的作用下分解出Notch胞内段,与胞核靶基因结合,促进下游效应蛋白合成,与STAT3蛋白共同作用,促进细胞癌变,提升肿瘤细胞耐药性[18-19]。ALSHAER W等[20]研究发现,抑制STAT3、Notch1蛋白的表达可增强乳腺癌MCF7细胞对多柔比星的敏感性,降低其化疗耐药性。本研究结果显示,与耐药组比较,白花蛇舌草组STAT3、Notch1蛋白的表达水平降低,且在白花蛇舌草基础上增用STAT3/Notch轴激活剂Jagged1,可减弱白花蛇舌草对胃癌细胞的化疗增敏作用,表明白花蛇舌草可能通过介导该轴降低胃癌细胞的化疗耐药性。

综上所述,白花蛇舌草可提高顺铂对胃癌细胞的增殖抑制率,减弱糖酵解并促进其凋亡,降低胃癌细胞化疗耐药,其作用机制可能与抑制STAT3/Notch轴的活性有关。