青稞根边缘细胞的发育特性及其对密花香薷挥发油胁迫的响应

周汐婕,肖云星,谢雨思,马丹炜

(四川师范大学生命科学学院,成都 610101)

【研究意义】青藏高原独特的“高”“寒”自然环境,形成了高寒草甸敏感脆弱的生态系统[1]。受到全球气候变化、人类干扰以及过度放牧等因素的影响,青藏高原草地逐渐退化,毒杂草扩张,严重威胁了青藏高原农作物的生长[2]。青稞(HordeumvulgareL.)因具有适应性广、耐寒、抗逆能力强等特点,常被种植在海拔1400～4100 m的地方[3],是青藏高原地区极为重要的农作物[4]。探究青稞面对毒杂草扩张采取的防御响应机制为青藏高原农田生态系统农作物的保产增产提供理论依据。【前人研究进展】化感作用是指植物通过淋溶、挥发、残株分解等途径向周围环境释放化感物质,从而对周围植物或微生物造成有利或有害影响[5],其中负面影响被称为化感胁迫[6]。类似于入侵植物的“新武器假说”,除了争夺光照、水分、养分等资源竞争外,毒杂草例如黄花棘豆(Oxytropisochrocephala)、瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)、黄帚橐吾(Ligulariavirgaurea)等会利用化感作用提高自身的竞争力[7]。根边缘细胞(Root border cells, RBCs)由根冠分生组织发育形成,被程序化分离后聚集在根冠周围,并与其分泌的粘液共同组成根胞外陷阱(Root extracellular traps,BETs)[8]。当受到包括化感作用在内的外界胁迫时,BETs能吸附、中和土壤中的有毒物质,调节根际环境,保护根尖免遭伤害,是植物抵御土壤环境胁迫的的重要屏障[9]。植物产生的RBCs对外界刺激十分敏感,其数量因种类而异,大多数植物每天都会产生数千个具有特殊基因表达模式、代谢活跃的RBCs[10]。以往研究更关注化感物质对受体植物RBCs防御功能以及周围环境的干扰作用,而忽略受体植物RBCs对化感胁迫的防御响应[6, 11]。密花香薷(ElsholtziadensaBenth.)是唇形科(Labiatae)香薷属(Elsholtzia)芳香类的多年生草本植物,含有丰富的挥发油[12],是青藏高原农田生态系统常见的优势毒杂草[13],其水浸提液对受体植物具有显著的化感抑制效应[14]。在密花香薷不断扩张的同时,其挥发性化感物质必定会通过土壤吸附、残株腐解等途径不断进入土壤作用邻近植物的根系[15]。而青稞RBCs为了保护根尖会作出怎样的响应并未得到解决。【本研究切入点】以密花香薷挥发油为供体,采用纯琼脂悬空气培养法,在研究青稞RBCs发育特性的基础上,探讨青稞RBCs从细胞活性、粘胶层厚度、胞内ROS水平变化以及细胞死亡类型等方面对不同浓度密花香薷挥发油的响应。【拟解决的关键问题】探讨农作物青稞RBCs面对密花香薷挥发油化感胁迫的响应机制,为青藏高原农田生态系统农作物的保产增产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及来源

供体植株密花香薷,2019年7月采于四川省阿坝藏族羌族自治州红原县阿西乡(102°55.944′ E, 33°41.023′ N)的高寒草甸。该地海拔3470 m,属高原寒温带湿润季风气候,常年无夏,无绝对无霜期[16]。青稞种子购于四川省甘孜藏族自治州道孚县。泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK(20 mmol/L×0.02 mL)和活性氧检测试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 挥发油母液的制备

将采集的成熟期密花香薷全株阴干后剪成1～2 cm的小段,采用水蒸气蒸馏法提取密花香薷挥发油[17],经无水 Na2SO4除水后置于棕色试剂瓶-20 ℃保存。取挥发油10 μL,用体积分数为25%的二甲基亚砜(DMSO)稀释至100 μL得到0.1 μL/μL挥发油处理母液。

1.3 材料培养及处理

1.3.1 材料培养 挑选颗粒饱满、大小均一的青稞种子,用0.5% KMnO4溶液消毒10 min,蒸馏水清洗6次后置于25 ℃恒温培养箱浸种12 h,转移至铺有湿润双层无菌纱布的瓷盘中继续在25 ℃环境中无光照催芽24 h。待种子露白后,胚根朝外插入装有0.8%质量分数纯琼脂的培养瓶(容积200 mL、直径9 cm、高8.5 cm)中无光照倒置培养[15]。

1.3.2 RBCs的收集 待青稞根长达到5、10、15、20、25、30、35、40、45和50 mm时,分别随机剪取5 mm根尖10个,置于装有100 μL ddH2O的离心管中,漩涡振荡30 s,吸出细胞悬液,再用50 μL ddH2O冲洗根尖2次,收集细胞悬浮液并用微量进样器(规格1000 μL)吸打3～4次,使成团的RBCs分离,制得细胞悬液[15]。

1.3.3 试验处理 A组:分别吸取挥发油母液1、2、3、4和5 μL,用DMSO补充至5 μL配置成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08 和0.10 μL/μL的处理液(记为T1、T2、T3、T4和T5,T5与挥发油处理母液的浓度一致)。加入200 μL根长为40 mm时制得的细胞悬液(此时RBCs数量达到峰值,活性较高)并混匀。以5 μL 25%体积分数的 DMSO为溶剂对照,以5 μL PBS溶液为阴性对照(记为Control),所有处理均置于25 ℃恒温培养箱中暗培养30 min,每个处理重复6次。B组:分别将5 μL PBS溶液(Control)、5 μL挥发油处理母液、5 μL挥发油处理母液+泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK(终浓度为10 μmol/L)(记为Mixture)加入装有200 μL细胞悬液的离心管中,混匀并置于25 ℃恒温培养箱中暗培养30 min,每处理重复6次。处理结束后,用蒸馏水漂洗 2 次进行指标测定。

1.4 指标测定

1.4.1 RBCs原位观察 随机取1个长度约为4.0 cm的根尖置于载玻片上,在根尖上滴1滴蒸馏水,将根冠浸入水中数秒后滴1滴吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染液,室温下避光染色3 min,用Nikon ECLIPSE 55i荧光显微镜观察并拍照。

1.4.2 RBCs形态观察和数量测定 在载玻片上滴1滴细胞悬液,用0.1%质量分数的番红溶液染色,再用测微尺测定细胞大小,每个细胞长度和宽度各测定3次,测定每种形态的细胞各10个。参考Kubo等[18]的方法,取10 μL细胞悬液于细胞计数板上,滴加5 μL 1%体积分数的台盼蓝染液,均匀混合后室温避光染色5 min,立即在Nikon ECLIPSE 55i显微镜下计数观察并统计细胞存活率,染成蓝色的为死细胞,未着色的为活细胞。每个处理重复8次。计算细胞数量:

细胞个数/mL=N/4×104×稀释倍数

式中,N为4个16格细胞总数。

1.4.3 RBCs粘胶层厚度测定 参考Ropitaux等[19]的方法,取细胞悬液8 μL,加入8 μL印度墨水均匀混合后染10 min,用Nikon ECLIPSE 55i显微镜在明场下40 ×观察并拍照测量粘胶层厚度。每处理测5个细胞,每个细胞测6个不同位置。

1.4.4 RBCs活性测定 参考Singh等[20]的方法,取细胞悬液20 μL加入离心管中,滴加8 μL AO/EB混合染液并混匀,染色2 min。LEICA DM300荧光显微镜下观察并拍照。每个处理重复5次。橘红色为死细胞,绿色为活细胞。统计死亡细胞的数量和细胞总数,计算RBCs存活率:

RBCs存活率=活细胞数/总细胞数×100%

1.4.5 RBCs内ROS含量测定 按照上海碧云天生物科技有限公司的ROS检测试剂盒操作说明,用多功能细胞分析仪(SpectraMax M2,Molecular Devices,美国)在激发波长为488 nm、发射波长为525 nm下测定ROS相对荧光值[15]。

1.5 数据统计与分析

用 SPSS 20.0对相关指标进行单因素方差分析(One-way ANOVA) 和Tukey 检验多重比较(LSD)。数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 青稞RBCs的发育特性

2.1.1 青稞RBCs的形态特征 青稞RBCs围绕根尖释放,形成RBCs群保护层(图1-A);青稞的RBCs呈弧形(图1-B)、椭圆形(图1-C)和杆形(图1-D),其中椭圆形细胞长30～50 μm,宽16～30 μm;弧形细胞长40～90 μm,宽15～30 μm,杆形细胞长40～120 μm,宽10～30 μm。

每组处理进行8个重复。图中数据为平均值±标准差。不同小写字母表示Tukey 检验多重比较(LSD)下不同处理组之间在 95%水平上差异显著。下同。

2.1.2 青稞RBCs的数量特征 从图2可知,在根长5～50 mm,随着根长增加,青稞RBCs数量逐渐增加;当青稞根长为40 mm时,RBCs数量达到最高,约为1263个,此时RBCs数量为根长5 mm时的2.37倍。随着根长增加,RBCs数量逐渐下降。不同根长之间的RBCs存活率无显著差异(P>0.05),存活率均维持在90%以上。

2.2 青稞RBCs对密花香薷挥发油的响应

2.2.1 密花香薷挥发性油处理下青稞RBCs粘胶层厚度的变化 本研究的溶剂对照组和阴性对照组的粘胶层厚度等各种指标均无显著差异(P>0.05),排除溶剂DMSO对RBCs的影响。与对照相比,除最低浓度T1(0.02 μL/μL)之外,其余挥发油处理组均存在显著差异(P<0.05)。随着密花香薷挥发油浓度增大,RBCs粘胶层逐渐增厚(图3)。在最大处理浓度T5(0.1 μL/μL)下,密花香薷挥发油处理后的RBCs粘胶层厚度为对照组的2.64倍。密花香薷挥发性物质对青稞粘胶层RBCs有增厚效应。

2.2.2 密花香薷挥发油处理下青稞RBCs活性的变化 经 AO/EB 染色后,与对照组相比,经过密花香薷挥发油处理的青稞RBCs呈现浅橘红色荧光,细胞核呈现橘红色荧光亮斑,甚至部分细胞核已经裂解(图4-A),表明RBCs活性丧失,挥发油诱导了RBCs凋亡。不同挥发油处理组的细胞活性均与对照组呈显著差异(P<0.05),在最大浓度T5(0.1 μL/μL)处理下,细胞活性仅为对照组的40.17%,这说明密花香薷挥发油处理下,青稞RBCs活性下降且表现出明显的浓度依赖(图4-B)。

2.2.3 密花香薷挥发性物质处理下青稞RBCs内ROS含量的变化 随着密花香薷挥发油浓度增高,青稞RBCs内ROS含量呈上升—下降—上升趋势,均与对照组呈显著差异(P<0.05,图5)。ROS相对荧光值在T3浓度(0.06 μL/μL)处理下达到峰值(2.23)。随着挥发油浓度增高,细胞活性不断减低可以推断,青稞RBCs在密花香薷挥发油诱导下发生了氧化损伤,进而导致细胞凋亡。

A为挥发油作用下青稞RBCs及其粘胶层显微图;B为RBCs粘胶层厚度变化趋势图。图A中白色箭头所指的包裹在细胞周围的胶状物质为粘胶层。每组处理进行5个重复。

A为挥发油作用下的青稞RBCs的荧光显微图,绿色代表活细胞,橙红色表示细胞出现死亡特征;B表示RBCs活性的变化。每组处理进行5个重复。

每组处理进行6个重复。

当挥发油与泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同处理RBCs时,挥发油对RBCs的致死效应有所缓解(图6),与未使用Z-VAD-FMK相比,细胞活性升高17.3%,进一步证实了密花香薷化感作用诱导的青稞RBCs死亡类型为凋亡。

3 讨 论

3.1 青稞RBCs的发育特性

高等植物RBCs的形状、数量、活性受到植物种类、根尖分生组织类型等多种因素影响[21]。姜华等[22]发现绿豆(Vignaradiata)RBCs在发育初期呈球形,后随着根伸长在根的不同位置出现3种不同形态:椭圆形、长椭圆形和长条形。亚麻(Linumusitatissimum)释放的RBCs呈球形、丝状和细长型[23],豌豆(Pisumsativum)的RBCs除部分为圆形外,大多数适度弯曲呈弧形[24]。本研究中,青稞RBCs的形态呈圆形、弧形以及杆形。烟草(Nicotianatabacum)每天产生十几个RBCs[21],茄科植物约为100个[25],棉花 (Gossypiumhirsutum)则高达上万个[26]。本研究中,青稞RBCs在根长5～40 mm,随着根长增加,其数量逐渐增加,当根长为40 mm时,RBCs的数量达到最高,约为1263个,之后随着根长增加,RBCs数量逐渐下降,这些差异可能与RBCs发育相关的基因特异性表达有关[27]。

每组处理进行5个重复。

目前,有关化感作用对受体植物生长发育的形态指标观测以及生理过程变化的研究大多属于表观现象,而一切生命关键问题都要从细胞中寻找[6]。化感作用是复杂的自然现象,受体植物对化感胁迫所表现的敏感性和耐受性也涉及复杂的反应过程[11]。由多细胞构成的高等植物,其生命活动受不同细胞协调和制约。因此以单细胞模式系统作为化感作用的靶标,更能够直观地洞察到化感作用这一自然现象的本质[6]。自然条件下,植物挥发性化感物质既可以通过空气直接作用于受体植物,也可以借雨雾淋溶进入土壤作用于邻近受体植物[28]。虽然土壤能在一定程度上削弱化感物质的影响,以土壤为基质的试验更能贴近自然状况,但有研究表明苘麻(Abutilontheophrasti)挥发油通过空气、浸水滤纸和土壤3种载体都能在不同程度下抑制小麦(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)和大豆(Glycinemax)种子的萌发和幼苗的生长[29]。同时,植物RBCs代谢旺盛,可在体外保持活力数月,甚至可以进行细胞分裂。将豆类、谷物和棉花(G.herbaceum)等植物的根尖浸入蒸馏水后,RBCs便可自动释放到水体中,取材方便、经济且RBCs对外界刺激十分敏感[10]。因此,RBCs逐渐被作为一种方便的模式系统应用到植物逆境胁迫的研究中。本研究中,青稞不同根长的RBCs存活率仍维持在90%以上,存活率高于水稻(Oryzasativa)、绿豆等其他植物的RBCs[22],适合作为受体继续开展植物RBCs化感胁迫的研究。

3.2 青稞RBCs对密花香薷挥发油胁迫处理的响应

RBCs及其BETs是根系与土壤之间的一道生物屏障[15]。当植物受到化感胁迫时,在早期时会激活体内防御相关的反应,包括对化感物质的直接防御[30]和吸引有益微生物的间接防御[31]。许多植物的RBCs都能直接对外来的化感胁迫做出差异性响应。葡萄(VitisviniferaL.)根产生的自毒物质ρ-对羟基苯甲酸可增加RBCs数量,促进次生代谢物质和水杨酸积累,以激活葡萄抗氧化系统来缓解胁迫[32]。在土荆芥(ChenopodiumambrosioidesL.)等3种入侵杂草水浸提液的作用下,苦荞麦(FagopyrumtataricumL.)RBCs粘胶层厚度增加,细胞内ROS、NO水平升高,线粒体膜电位下降,细胞活性降低甚至死亡[33]。本研究中,在密花香薷挥发油胁迫下,青稞RBCs粘胶层随浓度升高而增厚,细胞活性持续降低,细胞内ROS水平显著升高。当植物遭受逆境胁迫时,因线粒体功能失调而产生过量的ROS,一旦ROS超过细胞清除ROS的限度,就会发生氧化损伤,产生过量的氧化蛋白,细胞器受损[34]。另一方面,ROS可作为信号分子启动自噬过程,通过吞噬和降解氧化物和受损细胞器,缓解由ROS带来的氧化损伤[35]。除此以外,ROS 还可作为信号分子刺激、诱导细胞凋亡,再由死亡的细胞及其周围粘液吸附化感物质,并通过BETs阻滞化感物质进入根尖分生区,抵御其毒害效应,保护根系健康生长[15, 36]。本研究中的青稞在面对密花香薷挥发油的胁迫处理时可能采取了类似的应对策略。

当挥发油与泛Caspase抑制剂共同作用时,由挥发油引起的细胞活性降低的现象得以缓解,表明密花香薷化感挥发物质诱导了青稞RBCs的氧化损伤,最终引起RBCs发生Caspase依赖性的细胞凋亡。荧光染色的细胞结构特征也证明了这一论断。由此可见,青稞RBCs为应对密花香薷挥发油的胁迫,通过分泌粘液物质增厚粘胶层,并释放ROS以促进细胞凋亡,增强由RBCs及其BETs形成的生物屏障,从而进一步阻滞化感物质侵入根尖分生区。除此以外,RBCs还可以通过增加RBCs数量,降低根细胞中ROS水平和MDA含量来缓解化感胁迫对植物的伤害[37]。已有研究表明,水稻[38]、莴苣(Erodiumcicutarium)[39]等植物释放的具有化感作用的挥发物绝大多数是萜类化合物,而密花香薷挥发油的化感主效成分则需要进一步研究确定。

4 结 论

青稞RBCs呈圆形、弧形以及杆形,且数量大、活性高,适合作为受体继续开展植物RBCs化感胁迫研究。随着挥发油浓度增加,青稞RBCs粘胶层显著增厚,细胞活性逐渐下降,细胞内ROS水平显著升高,当挥发油和泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同作用时,由挥发油引起的细胞活性降低现象得以缓解。由此推测,青稞RBCs受到密花香薷挥发油胁迫后,通过增厚粘胶层抵御外界胁迫侵害,接着产生 ROS诱导细胞凋亡,从而缓解化感毒性。