野山杏总黄酮对LPS诱导鸡肝炎的影响

2023-09-12束佳敏郭元印卫丁一刘浩然依斯马依力何子涵戴小华

新疆农业科学 2023年8期

束佳敏,郭元印,卫丁一,刘浩然,依斯马依力,黄磊,何子涵,姚刚,戴小华

(新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052)

0 引言

【研究意义】野山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam.)属蔷薇目、蔷薇科李属亚乔木植物,主要分布于新疆、山西等西部地区[1]。野山杏中含有氨基酸、多糖、黄酮类化合物等多种成分[2-4]。野山杏具有抑菌、抗病毒、抗感染、保肝、降血脂及抗氧化等作用[5-10]。通过提取分离纯化野山杏总黄酮,分析其对LPS诱导鸡肝炎的影响,对丰富野山杏药效学价值并为畜禽抗炎药物的开发有实际意义。【前人研究进展】有研究[11]采用RP-HPLC法分析了新疆野山杏果肉中的原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素等4种黄酮类化合物。谷虹霏等[12]研究表明,野山杏总黄酮可显著延长小鼠疼痛反应痛域,减轻局部疼痛反应,具有明显的镇痛作用。戴小华等[13]发现野山杏总黄酮对肿胀反应和毛细血管通透性增加有显著的抑制作用,对肿胀和渗出等局部急性炎症有一定的抑制作用。【本研究切入点】阿依姑丽等[14]发现野山杏总黄酮可降低高血脂大鼠的血脂,减少肝脏损伤,抑制肝脏脂质过氧化过程并具有一定的剂量依赖性。需分析野山杏总黄酮对LPS诱导鸡肝炎的影响。【拟解决的关键问题】通过LPS诱导鸡肝炎模型,测定鸡体温、体重变化和血液学参数及血液生化指标,分析鸡肝脏病理变化及野山杏总黄酮对鸡肝炎的影响,为畜禽养殖业过程中发生的急性炎症提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 野山杏

野山杏干燥果肉(购自新疆哈密伊吾县天苇生物科技有限公司),LPS脂多糖(L2880,Sigma)、芦丁(B20771,上海源叶生物科技有限公司)、吲哚美辛(R018115,罗恩试剂)、大孔吸附树脂(D101,陕西博晖生化科技有限公司)、伊红染液(Servicebio G1001,武汉赛维尔生物科技有限公司 )、苏木素染液(Servicebio G1004,武汉赛维尔生物科技有限公司);黄羽肉鸡购自天康生物股份有限公司。

1.1.2 主要仪器

兰格恒流泵(BT00-300T,河北省保定兰格);全自动血细胞分析仪(PE-6800,深圳市普康电子有限公司);尼康显微镜(712900,尼康仪器上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

90只14日龄黄羽肉鸡,平均体重为(192.73±2.61) g,将90只黄羽肉鸡随机分为6组,每组15只,分别为空白对照(生理盐水组)、模型组(LPS组5 mg/kg LPS)、阳性对照组(吲哚美辛组1 mg/kg)、野山杏总黄酮低剂量组(50 mg/kg)、野山杏总黄酮中剂量组(100 mg/kg)、野山杏总黄酮高剂量组(200 mg/kg),剂量组和阳性对照组组气管滴注;空白对照组按照等量无菌生理盐水腹腔注射,试验进行7 d。

饲养条件:清洁级动物房,室温保持在27℃至29℃,自由饮水饮食,给予标准动物饲料。各实验组在同栋鸡舍常规饲养,在雏鸡入鸡舍前,鸡舍用福尔马林熏蒸消毒。饲养管理按照《肉鸡饲养管理手册》执行。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 野山杏总黄酮

野山杏粉碎后,经超声、离心、抽滤、旋转蒸发得野山杏总黄酮粗提物,经D101大孔树脂进行分离纯化得野山杏总黄酮纯提物,可冷冻干燥备用;以芦丁为标准品、亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液、氢氧化钠、60%乙醇等汇制标准曲线并测定总黄酮含量。

1.2.2.2 体温、体重

每日观察黄羽肉鸡的精神状态,测量体温、体重等基本生理指标;每日上午10:00开始,以0、1、2、3、4、8、12和24 h测量每组每只鸡直肠部位的体温;称量每组每只鸡体重。

1.2.2.3 血常规参数及血液生化指标

黄羽肉鸡经LPS诱导24 h后,进行翅下静脉采血,收集血样,采用全自动血细胞分析仪对全血中的白细胞总数(WBC)、淋巴细胞数(LYM#)、中间细胞数(MID#)、中性粒细胞数(GRAN#)、红细胞数(RBC)、红细胞比容(HCT%)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞分布宽度SD(RDW-SD)、红细胞分布宽度CV(RDW-CV)、血红蛋白含量(MCH)、血红蛋白(HGB)、血红蛋白浓度(MCHC)等12项血常规参数进行检测;采用ELASA试剂盒对血清中的ALT、AST两种血液生化指标进行分析。

1.2.2.4 肝脏病理切片

LPS诱导24 h后,采集完血样后屠宰解剖,统一选取右侧肝脏制作石蜡切片,显微镜400倍进行观察。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 野山杏总黄酮对LPS诱导鸡肝炎体温影响

研究表明,从1 h时开始野山杏各剂量组对LPS导致的体温升高具有下调作用,1 h时低剂量组作用极显著(P<0.01),2 h时低、中剂量组亦能极显著下调体温,3、4 h各剂量组均能极显著下调体温(P<0.01),8、12、24 h对体温的改变程度不同(P<0.01,P<0.05)。图1

注:#表示模型组与空白对照组比较,*表示实验组与模型组比较,△表示阳性对照组与模型组比较,P<0.05表示差异显著(单符号),P<0.01表示差异极显著(双符号),下同

2.2 野山杏总黄酮对LPS诱导鸡肝炎体重影响

研究表明,野山杏总黄酮各剂量组对体重变化影响极显著(P<0.01)。与模型组相比,体重变化有所提高,随着剂量增加体重随之增加。图2

图2 野山杏总黄酮下LPS诱导鸡肝炎体重变化

2.3 野山杏总黄酮对LPS诱导鸡肝炎血常规指标影响

研究表明,与炎症相关的白细胞总数、淋巴细胞数、中间细胞数和中性粒细胞数均有变化。野山杏总黄酮各剂量组均可显著或极显著(P<0.05,P<0.01)逆转LPS导致的炎性细胞增多,且对白细胞总数、中间细胞数的恢复存在剂量依赖性。表1

表1 野山杏总黄酮对鸡血常规检测(±SE,n=15)

Tab.1 Routine detection of total flavonoids of Apricot apricot in chicken blood

表1 野山杏总黄酮对鸡血常规检测(±SE,n=15)

指标Indicators空白对照组Blank control group模型组Model group低剂量组Low dose group 中剂量组Dose group 高剂量组High dose group阳性对照组Positive group白细胞总数Total leucocyte count (109/L)89.81±3.05114.94±1.27##86.54±1.40∗∗83.38±2.88∗∗81.57±1.70∗∗83.37±2.83△△淋巴细胞数Lymphocyte count (109/L)73.08±2.6382.73±3.10##68.93±1.23∗∗69.73±3.26∗∗68.57±1.34∗∗68.42±2.37△△中间细胞数Intermediate cell number (109/L)7.13±0.288.41±0.25##7.71±0.20∗6.99±0.23∗∗6.60±0.24∗∗6.61±0.28△△粒细胞数Granulocyte count (109/L)7.50±0.3010.59±0.79##8.88±0.50∗6.69±0.45∗∗7.38±0.46∗∗7.61±0.39△△红细胞数Red blood cell count (1012/L)2.03±0.102.42±0.10##2.56±0.042.41±0.081.82±0.11∗∗2.34±0.08红细胞压积Hematocrit (%)26.93±1.2431.53±1.73##32.08±0.4330.14±0.8423.15±1.27∗∗29.55±1.16红细胞平均体积Mean erythrocyte volume (fL)132.53±1.33124.79±0.84##126.18±0.77127.46±1.31130.78±1.07∗∗126.46±1.16红细胞分布宽度SDRed cell distribution width SD (%)41.02±0.7136.43±0.31##36.63±0.6936.54±0.6538.29±0.74∗36.64±0.50红细胞分布宽度CVRed cell distribution width CV (%)10.89±0.2110.15±0.07##10.09±0.159.97±0.1510.22±0.259.91±0.22血红蛋白含量Hemoglobin content (pg)68.63±1.7156.73±0.50##60.56±1.0864.73±2.54∗∗78.25±4.17∗∗60.16±1.09血红蛋白Hemoglobin(g/L)151.15±4.54139.64±3.33#155.14±2.52∗∗152.86±3.20∗∗150.79±3.19∗144.45±5.85血红蛋白浓度Hemoglobin concentration (g/L)518.31±11.00455.60±4.85##480.57±8.19504.15±9.62∗∗604.18±29.24∗∗474.15±7.50

2.4 野山杏总黄酮对LPS诱导鸡肝炎血液生化指标影响

研究表明,野山杏总黄酮各剂量组均能降低LPS导致的ALT、AST水平升高,尤其极显著(P<0.01)降低ALT的活性,但对AST的影响程度弱于ALT,野山杏总黄酮各剂量组对两者的影响还存在剂量依赖性。图3,图4

图3 野山杏总黄酮下LPS诱导鸡肝炎ALT含量变化

图4 野山杏总黄酮下LPS诱导鸡肝炎AST含量变化

2.5 野山杏总黄酮对LPS诱导鸡肝炎肝脏组织结构影响

研究表明,空白对照组肝小叶结构清晰;经LPS诱导后,鸡肝脏出现损伤,模型组炎性细胞增生,巨噬细胞聚集,中央静脉有炎性细胞浸润,肝小叶轮廓不清晰;野山杏各剂量组对肝小叶的损伤有一定的改善作用,中央静脉中炎性细胞浸润减少,巨噬细胞聚集减少;尤其高剂量组改善效果较好,中央静脉清晰可见,炎性细胞浸润明显减少;阳性对照组改善效果最好,肝板排列清晰,炎性细胞侵润较少。图5

注:A:空白对照组,B:模型组,C: 低剂量组,D: 中剂量组,E: 高剂量组,F:阳性对照组,所指为中央静脉,↑所指为炎性细胞,△所指为巨噬细胞

3 讨论

管晓辉等[15]研究发现,多毛橐吾总黄酮可以抑制NF-κB信号途径的活化,具有显著的抗炎效果;周康盛等[16]报道了黄花棘豆所含的黄酮类化合物具有抗乙型肝炎病毒的生物活性;赵兴辉等[17]研究表明,镰形棘豆总黄酮可改善乙肝大鼠肝组织损伤,可抑制肝纤维化并保护肝功能;雷斯瑀等[18]发现赶黄草总黄酮对酒精性肝损伤有较好的治疗作用;刘舒凌等[19]分析得出,饿蚂蝗总黄酮具有抗鸭乙型病毒性肝炎作用;李晓东等[20]发现山楂叶总黄酮可减轻氧化反应导致的细胞损伤和肝组织炎症,可防止非酒精性脂肪性肝炎的进展。LPS为细菌内毒素,可引发细菌感染、神经系统疾病、心血管病、肾功能衰竭、内毒素败血症等全身性炎症性疾病[21],常被用作刺激因子调控IL-6、IL-1β等相关炎性因子的表达,构成炎症模型[22]。LPS诱导后,动物机体的精神状态及各项生理指标均会发生变化,如体温升高、消瘦、食欲不振等临床特征[23]。研究发现LPS诱导鸡肝炎后,鸡出现精神不振、食欲不佳等现象;结果表明,经LPS诱导后,体温会升高,但不同时间对体温的影响程度不同,即野山杏总黄酮能够使体温下调至正常体温(0 h),可缓解LPS诱导的体温升高。通过对比灌胃前、后的体重变化发现,腹腔注射LPS会导致鸡的体重增加减慢,但野山杏各剂量组增加了炎症条件下黄羽肉鸡的体重,对炎症造成的体重减轻有一定的缓解作用,对鸡生长有一定促进作用。

血常规中白细胞相关参数可以判断机体是否存在炎症,红细胞相关参数可以判断机体是否有贫血情况[24]。有研究表明[25]血红细胞指标的变化与肝损伤程度有关。研究结果表明,野山杏总黄酮不仅能缓解LPS诱导的炎症,同时可缓解LPS引起的潜在贫血。

肝炎会导致血清ALT、AST含量升高,这与肝损伤的程度呈正相关,ALT、AST含量是检测肝损伤最敏感的指标[26]。ALT升高反映肝细胞质受损,AST升高说明肝细胞结构受损。通常肝细胞受损时,ALT先释放进入血液,当肝细胞损伤危害到线粒体时,AST也会释放进入血液。当AST显著高于ALT时,提示病变的慢性化和进展性[27]。野山杏总黄酮对鸡肝损伤具有保护作用,其中高剂量组抑制效果最佳;野山杏总黄酮对肝组织病变有明显的改善,使肝小叶结构基本恢复,炎性体细胞浸润得到抑制,肝细胞形态和排列基本恢复,野山杏总黄酮能改善LPS引起的鸡肝组织病理损伤,对家禽养殖过程中产生的急性炎症有一定的缓解和改善作用。