浅析PCR技术在药品检验领域的应用

杨 青

（武威市药品检验检测中心，甘肃 武威 733000）

药品作为一种特殊的商品，关乎人民的身体健康，甚至生命安全，药品检验是药品质量控制的重要内容，检验结果的准确性是药品检验工作的核心内容。传统的药品检验手段已不能满足人民的需求，随着科技水平的日益提升，应运而生了许多新技术新设备，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术就是其中之一。目前，针对PCR技术在药品检验中的应用进行了许多研究，药品检验法定标准也已收载PCR技术。

Korana于1971年最早提出核酸体外扩增设想，他认为DNA（脱氧核糖核酸）经过变性后与合适的引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复这个过程就可以克隆tRNA（转运RNA）基因。Kary Mullis于1985年利用DNA变性、复性原理，发明了PCR技术。后来，由于Keohanog发现了耐热的Taq DNA 多聚酶而使PCR技术被广泛应用。经过30多年的发展，PCR技术被多次改进，使其从一种定性的分析方法发展到定量测定，发展出了RT-PCR（逆转录-聚合酶链式反应）、FQ-PCR（实时荧光定量-聚合酶链式反应）等十几种PCR技术。

1 PCR技术原理

PCR技术是一种模拟DNA天然复制过程的体外核酸扩增技术，由变性-退火-延伸3个基本步骤构成，通过变性-退火-延伸过程的不断重复循环，短时间内将特定DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

2 基于PCR技术的分子生物学技术

2.1 FQ-PCR

FQ-PCR（Real-time Fluorescence Quantittative PCR，实时荧光定量PCR），利用荧光能量传递技术在PCR反应中加入荧光报告基团或荧光基团，根据荧光信号的累积实时监测整个PCR反应进程[1]。FQPCR技术可用于检测禽源性生物制品和药品中的微生物检验。

2.2 RFLP

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶长度多态性方法），利用限制性内切酶特异性切割待测的DNA片段，通过片段的多样性比对不同来源基因型差异。RFLP技术可以鉴别中药材和饮片种属，也可对掺伪程度进行半定量检测。

2.3 AP-PCR或RAPD

AP-PCR或RAPD（Arbitrarilyprimed Polymerase Chain Reaction or Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA标记），基于PCR技术建立的可对整个序列的基因组进行分析的分子技术，可用于中药材和饮片真伪鉴定和亲缘关系研究。

2.4 ISSR

ISSR（Inter-simple Sequence Repeat，简单重复序列间扩增），以锚定的微卫星DNA为引物，加入非重复的锚定碱基后进行的PCR扩增。ISSR技术可用于中药材和饮片鉴别、亲缘关系分析和遗传多样性研究[2]。

3 PCR技术在药品检验领域中的应用

3.1 PCR技术在中药鉴定中的应用

传统的中药鉴别主要依靠外观性状特征，但由于中药材、饮片及复方中药制剂等因为成分复杂，产地分散，不同产地的中药材成分存在很大差异，所以传统鉴别方法不能够达到精准鉴别的要求。随着科学技术日新月异的发展，PCR技术以其特异性、灵敏性、重复性等优点，在药品检验领域占据一席之地，特别是在中药材和饮片鉴定、生物制品中毒菌种的鉴别及药品中微生物的快速检验等方面发挥着日益重要的作用，部分方法已被收载入相关标准，这为完善中药质量评价体系，保证中药安全、有效、可控提供了新思路新方法。

3.1.1 中药材和饮片真伪鉴定

2020年版《中国药典》就收载了川贝母、石斛、乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇5个品种（其中前2个品种用RFLP法，其余品种用PCR法）的PCR技术分子生物学鉴别方法，并把中药材DNA条形码分子鉴定法列入指导原则。研究还发现各类PCR技术均可用于动物类和植物类中药材和饮片的鉴别，其中：基于正确的引物设计和合适的PCR反应体系建立的特异性PCR技术可用于鉴别平贝母[3]、区分梅花鹿茸和马鹿茸[4]等；通过优化PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等建立的快速PCR技术可鉴别蛇类中药乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇的真伪[5]；FQ-PCR技术用于鉴别西红花和红花源性成分[6]、小活络丸中的小麦粉掺伪[7]等；RFLP技术可用于鉴别川贝母[8]、西洋参和人参[9]等；RAPD技术可用于鉴别牛蒡子及其混淆品[10]、厚朴正伪品[11]等；ISSR技术可用于鉴别射干及其混伪品鉴别[12]、黄精和卷叶黄精[13]等。

3.1.2 中药材和饮片遗传关系和亲缘关系

首先是在植物类中药材中的应用，已有研究发现利用RAPD技术可对4种10个中韩牛膝类样品进行遗传关系研究[14]；ISSR技术可用于研究贵州不同产地的粗毛淫羊藿植物的遗传多样性和亲缘关系[15]、不同生长环境中的锦灯笼遗传多样性分析[16]，通过研究植物类中药材遗传关系和亲缘关系，为植物类中药材和饮片育种选种提供一定的技术指导。其次是在动物类中药材中的应用，由于动物类中药材在使用时常常磨成粉末，传统的鉴别方法不能很好地进行种属区分，PCR技术通过亲缘关系研究，为动物类中药材和饮片质量控制提供依据，王自强等[17]就通过常规PCR和FQ-PCR技术进行亲缘关系研究，达到对猪、牛、羊源性成分的鉴定。

3.2 PCR技术在生物制品检验中的应用

《中国药典》2020年版中FQ-PCR检查法用于禽源性生物制品（即禽源性疫苗）的病毒检测，特别是流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗种子批毒种的外源性禽病毒检测，使得病毒检测的方法灵敏度更高、专属性更强、适用性更广、可靠性显著提升，是新版药典对药品质量控制手段的进一步补充和完善。

除了《中国药典》收载的方法，其他PCR技术在药品检验中也被广泛用于生物制品毒种的遗传稳定性研究。例如，韩剑锋等[18]采用FQ-PCR技术快速鉴别禽流感灭活疫苗H5、H9、H7亚型，为有针对性地选择适宜的禽流感灭活疫苗提供了技术支持。刘黎红等[19]采用相似的RT-PCR法进行毒种基因遗传稳定性研究，发现对流感减毒活疫苗的生产用工作毒种A扩增10代后获得与原始种子代次的同源性大于99%的毒株，说明PCR技术可研究毒种的遗传稳定性，在选择疫苗毒种的传代次数方面发挥作用，选择毒力较小、遗传稳定性好的毒株用于生产减毒活疫苗。闫明科[20]通过利用PCR技术测定维酶素片中是否存在阿氏假囊酵母菌的特异性DNA分子片段，进而达到检验维酶素片质量的目的。

3.3 PCR技术在药品微生物检验中的应用

与2020年版《中国药典》微生物检验的传统培养法相比，PCR技术具有直观检测微生物，重复性好、特异性与敏感性高的优点，其在药品病毒毒种鉴定和菌种鉴定中也有研究，且多采用的是FQ-PCR技术。例如，李秀珍等[21]采用PCR-焦磷酸测序法对药品中5种致病菌进行快速鉴定，刘婷婷等[22-23]基于FQPCR法快速检验药品中沙门菌和金黄色葡萄球菌，杨飞[24]基于FQ-PCR法快速检测60批次药品中的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

4 小结

药品检验是药品质量控制、监督的重要技术手段，更是确保用药安全的重要环节。目前，我国药品检验依据的是《中国药典》、局颁或部颁以及地方标准，多采用性状和理化鉴别，利用PCR技术可提高药品鉴别的准确性。基于PCR技术的分子生物学方法在药品检验中的用途如图1所示，主要有：①中药材和饮片鉴定，现有文献表明，FQ-PCR、RFLP、RAPD、ISSR技术均可作此用途；②植物类和动物类中药材和饮片遗传关系研究；③禽源性生物制品的外源性病毒污染检查，已被《中国》药典收载的是FQ-PCR；④研究毒种的遗传稳定性，选择毒力较小、与原始种子同源性高、遗传稳定性好的传代毒株用于生产减毒活疫苗；⑤利用药物中含有的特异性DNA分子片段进行药物质量鉴定；⑥药品中的菌毒种鉴别。这一方面有效补充了传统中药材和饮片形态鉴别方法的盲区，另一方面为中药材育种栽培和减毒活疫苗传代毒株的选择提供了有力的技术指导，且实现了菌毒种的快速鉴别。

图1 PCR技术在药品检验中的应用

同时发现，基于PCR技术的分子生物学方法在药品检验领域的应用还存在不少问题：①用于中药材和饮片的PCR鉴别引物有限，导致目前药品检验法定标准收载的可用于PCR鉴别的品种较少；②除《中国药典》收载的PCR方法外，尽管各类PCR技术在中药材和饮片鉴别中的研究很多，但如何建立引物及选择合适的PCR方法研究较少，不同PCR技术在药品检验中的优劣势不明显；③中药材种植产地、方法栽培变异等因素不同，中药材遗传关系存在差异，导致中药材和饮片的质量差别较大，影响PCR方法的重现性与稳定性；④中药材和饮片中容易带有细菌、真菌和寄生虫等，在PCR扩增过程中如何排除非目标微生物和死菌的干扰的研究较少，而干扰微生物对利用PCR技术进行中药材和饮片鉴别的准确性影响较大；⑤目前，对药品中含有的特异性DNA分子片段研究较少，PCR技术不能广泛用于药品质量的鉴定；⑥减活疫苗毒种遗传稳定性研究中采用的方法均为RT-PCR法，其他PCR技术研究较少；⑦一般的分子标记鉴别仍需经过DNA的提取、PCR扩增、电泳检测3个步骤，不能达到中药材和饮片现场快速鉴别的目的。

文章总结概括了基于PCR技术的分子生物学方法在药品检验领域的主要应用，同时，也提出了PCR技术在药品检验中存在的瓶颈，尽管很多PCR技术方法还未被药典收录，但大量的研究已为其在药品检验中的广泛应用奠定了良好的基础，具备良好的应用前景，有潜力发展成为快速、准确、稳定的药品检验技术，将在药品检验领域发挥不可替代的作用。