不同番茄种质的耐涝能力评价

周露华 方俊仪 熊子墨 巫伟峰 刘佳瑞陆 乔 凌宏清 孔丹宇

（1.江西省中国科学院庐山植物园，九江 332800；2.南昌大学生命科学学院，南昌 330031；3.中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101）

随着全球气候变暖，气候环境的剧烈变化致使灾害性天气显著增多，洪涝灾害的发生面积和频率较以往明显上升［1-2］。近年来一些相对比较干旱的地区，如我国河南、山东等地，也遭遇突如其来的洪涝灾害，对农作物的栽培造成了极大影响［3-4］。因此更深入地研究植物耐涝机制，培育耐涝新品种作物，对应对气候变化的挑战非常重要。

淹水胁迫是植物较常见的非生物胁迫之一。当植物处于淹没状态时，由于无法从外界获得充足的氧气，植株处于缺氧状态，呼吸作用及光合作用受到限制［5］。长时间淹水胁迫会导致植物叶片失绿，植物生长停滞甚至植株死亡。针对淹水胁迫，不同的植物进化出不同的应对策略：有些植物，如水稻（Oryza sativa）可以通过叶片伸长、节间快速生长、叶柄迅速伸长等使植物重新接触到水面上方的空气，减轻植物缺氧状态以增强耐涝能力［6］；另一些植物则通过停止生长，降低自身代谢需求等应对洪涝胁迫，待洪涝消退后恢复生长［3，7-9］。当植物遭遇淹水胁迫时，会发生一些结构性变化以缓解淹水胁迫，如不定根的产生、通气组织的形成、径向氧缺失屏障的形成等［10-13］，除此之外还伴随着一些物质的积累，如活性氧（ROS）［14］。ROS 是一种信号分子，在植物适应胁迫的过程中参与调节多个应激途径［15］，但过量的ROS 会对植物造成直接的负面影响［16］。有研究表明，在植物处于非生物胁迫时，过量的ROS 与细胞内生物分子发生反应，可能造成组织坏死等不可逆转的损伤，甚至造成植物死亡［17］。因此淹水胁迫中植物的ROS 含量，可以在一定程度上反应植物的受胁迫程度。

不同植物对洪涝的耐受能力差别很大。水稻、中华天胡荽（Hydrocotyle hookerisubsp.chinensis）等植物比较耐涝［18］，而大豆（Glycine max）、番茄（Solanum lycopersicum）等植物的耐涝性比较差［19］。番茄原产于南美洲的安第斯山脉，是世界上最重要的蔬菜作物之一，在我国具有广泛的栽培面积。番茄对淹水非常敏感［19］，短时的淹水胁迫就能够对番茄产量造成重大影响。淹水胁迫会严重抑制番茄的生长［20］。刘聪聪等［21］对市场上部分番茄品种的耐涝性进行评估发现，红妃6 号、红钻石、台湾赞美、立新佳禧和千禧的耐涝性依次减弱；而郑积荣等［22］还发现多茸毛番茄品种的耐涝性较好。

目前植物耐涝机制研究主要集中在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana），以及水稻、大豆等农作物，对番茄的耐涝机制研究相对较少。有研究发现番茄的叶绿素合酶基因AUREA通过维持血红素稳态来平衡叶绿素合成和不定根的形成而发挥一定的耐涝功能［23］。此外，甜菜碱是介导植物响应环境胁迫的重要有机化合物，在淹水胁迫中促进生长、提高叶绿素浓度和超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性，进而保护植物免受氧化损伤；同时降低Na离子浓度，提高叶和根中的K离子浓度及茎和果实中的Ca 离子浓度，从而减少番茄涝害［24］。有研究发现番茄中存在类似于拟南芥涝害反应机制中乙烯介导的低氧或缺氧反应［25］，淹水胁迫能够诱导ERFs（ERF.A1，A3，B3，C6，D2，D4，E1，E4，F2，G1）特异性表达［26］，但是用乙烯处理番茄幼苗并不能提高其耐涝能力［25］。总体来说，对番茄耐涝机制的了解还很有限，缺乏可用于耐涝品种培育的关键基因。因此收集番茄种质资源并从中发掘耐涝型番茄对耐涝番茄品种选育和番茄耐涝机制研究非常重要，培育耐涝番茄新品种，应对番茄栽培中突发涝害的有效办法，也为后续番茄耐涝机制研究提供材料依据。因此，本研究通过对50 种番茄种质的耐涝能力评估，筛选出耐涝性较好的番茄种质用于后续耐涝品种培育，同时对具有代表性的耐涝型和淹水敏感型番茄种质进行进一步的分析。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

本研究地点位于江西省中国科学院庐山植物园南昌溪霞分园智能温室（28°53′N，115°49′E），属于亚热带季风性气候。

1.2 材料

供试材料为50 个不同的番茄种质（见表1），包括番茄（S.lycopersicum）25 个，樱桃番茄（S.lycopersicumvar.cerasiforme）16 个，醋栗番茄（S.pimpinellifolium）9个。

表1 50个番茄品种的相关信息Table 1 Information on 50 tomato varieties

1.3 试验方法

1.3.1 淹水试验设计

将番茄幼苗在石英砂介质中，用1/2 Hoagland培养液栽培至4 叶期后，选取生长健壮的番茄苗为供试材料。淹水试验中每个番茄种质均设置3 组处理，每组处理6 株番茄幼苗，对照（CK）组正常培养；半淹组淹至石英砂表面以上2 cm 处；全淹组淹没整个植株。淹水处理7 d 后，恢复正常生长7 d，统计各项生理指标。试验共进行3 次生物学重复。

1.3.2 测试指标与方法

在淹水试验中，对番茄在淹水条件下生长情况进行观测，并测量其株高、冠幅和叶绿素含量这3 个与淹水胁迫紧密相关的生理指标。株高的测量，使用直尺测量由石英砂表面至番茄苗顶端生长点的距离，处理后的平均株高/正常对照的平均株高=相对株高；冠幅的测量是使用Image J 软件对番茄正上方俯视视角照片的叶片覆盖面积进行计算所得，处理后的平均冠幅/正常对照的平均冠幅=相对冠幅；叶绿素含量（SPAD 值）是使用叶绿素仪（SPAD-502 PLUS，日本）测量番茄第2 叶叶片的SPAD 值，处理后的平均SPAD 值/正常对照的平均SPAD值=相对SPAD值。

1.3.3 耐涝型番茄和淹水敏感型番茄的比较分析

根据对50 个番茄种质的耐涝能力分析，挑选出1 个具有代表性的耐涝型种质TK017 和1 个淹水敏感型番茄种质TK039，并对两者进行进一步分析。在淹水试验中，测量其株高、叶绿素含量和冠幅；使用3，3′-二氨基联苯胺（DAB）组织染色法［27］对TK017 和TK039 的叶片进行染色并使用相差显微镜在10 倍物镜下进行观察；使用过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（Solarbio）分别测量两者的叶片中H2O2和MDA 的含量。过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性分别使用过氧化物酶及超氧化物歧化酶活性检测试剂盒（Solarbio）进行检测。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2021进行数据统计，使用Graph-Pad Prism 9.0.0 的单因素方差分析（Oneway ANOVA）对试验数据进行单因素方差分析，采用Turkey 法比较不同组间的差异性。并使用Graph-Pad Prism 9.0.0 软件制图，图中数据是平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 淹水处理中50 个番茄种质的株高、冠幅和SPAD值

测量50个番茄种质在半淹或全淹处理下的株高、冠幅和SPAD 值，并将其与正常生长的对照组进行比较。相对株高、相对冠幅和相对SPAD 值的分布如图1所示。在半淹处理下，受测番茄种质的相对株高、相对冠幅和相对SPAD 值整体上高于全淹处理；特别是半淹处理下约一半左右的番茄种质的相对株高和相对冠幅值大于1，说明在半淹胁迫刺激了这些番茄的节间伸长。在全淹处理下，绝大部分番茄种质的株高、SPAD 值和冠幅低于对照组，说明全淹状态下番茄的生长受到强烈抑制。

图1 淹水试验中50 个番茄种质的相对株高、相对冠幅和相对SPAD值分布*表示半淹处理和全淹处理在P＜0.05水平上差异显著Fig.1 Distribution relative plant height，relative crown width and relative SPAD values of 50 tomato germplasm under waterlogging stress* indicated significant differences between semi-submergence and submergence at the P＜0.05 levels

2.2 全淹处理7 d后50个番茄种质的存活率

在全淹处理7 d 后，50 个番茄种质中有32 个全部死亡，12 个全部存活，6 个处于中间型即部分植株存活。同时根据淹水试验中的存活率对这50个番茄种质进行分组（见表2），存活率100%的番茄种质为耐涝型，存活率为0 的种质为淹水敏感型，存活率处于0～100%的种质为中间型。

表2 50个番茄种质的耐涝能力分型Table 2 Types of waterlogging tolerance of 50 tomato germplasm

2.3 耐涝型TK017 和淹水敏感型TK039 的比较分析

为了进一步研究耐涝型和淹水敏感型番茄的生理水平差异，对3 次筛选试验中全淹处理7 d 后全部个体均存活的耐涝型樱桃番茄TK017 和全部个体均死亡的淹水敏感型樱桃番茄TK039 进行了进一步的分析。

2.3.1 TK017和TK039的淹水胁迫表型分析

TK017 和TK039 经过7 d 半淹和全淹处理之后恢复培养7 d 的表型如图2所示。在半淹胁迫处理后TK017 的节间较正常对照明显伸长，经恢复培养后TK017 的长势较TK039 旺盛；全淹处理中，TK017 经处理及恢复培养后仍可存活，TK039在全淹处理中全部死亡。

图2 TK017和TK039在淹水处理中的植株表型Fig.2 Phenotypes of TK017 and TK039 in waterlogged treatment

2.3.2 TK017和TK039在淹水处理中的株高、冠幅和SPAD值

TK017 和TK039 淹水处理7 d 后的株高、冠幅和SPAD 值如图3 所示。耐涝型TK017 在半淹处理下的株高和冠幅显著高于对照组，与其节间伸长的表型一致（见图2），而TK039在半淹处理下株高与对照组无明显差；在全淹处理下TK017 的株高、冠幅和SPAD 值显著低于对照组表明生长受到抑制，而TK039全淹处理下全部死亡。

图3 TK017和TK039在淹水处理中的生理指标变化不同小写字母代表处理之间在P＜0.05水平存在显著性差异；数值为平均值±标准差；下同Fig.3 Changes in physiological indices of TK017 and TK039 in waterlogging treatment Different lowercase letters in the same column represented significant difference at P＜0.05 level；data presented as mean±SD；the same as below

2.3.3 淹水处理中TK017 和TK039 叶片的DAB染色

淹水胁迫中ROS 的积累对植株的状态具有重要影响。为了观察在淹水处理中耐涝型和淹水敏感型番茄在ROS 积累上的差异，分别观察TK017和TK039在淹水处理2 d后第2片叶的DAB染色。

如图4 所示，在半淹处理中，TK017 和TK039的DAB染色结果与对照组相比无明显差异。而在全淹条件下，TK017 和TK039 的DAB 染色结果与对照相比明显加深，并且TK039 的染色结果比TK017 更深，表明在全淹条件下TK039 比TK017积累更多的活性氧。

图4 淹水处理中TK017（A）和TK039（B）叶片的DAB染色Fig.4 DAB staining of TK017（A）and TK039（B）leaves in waterlogging treatment

2.3.4 淹水处理中TK017 和TK039 叶片的过氧化氢（H2O2）及丙二醛（MDA）质量摩尔浓度测定

测定TK017 和TK039 在淹水处理2 d 后的第2 片叶的过氧化氢（H2O2）及丙二醛（MDA）质量摩尔浓度。结果如图5所示，TK017在半淹处理下的H2O2及MDA 质量摩尔浓度显著高于对照组；全淹处理下的过氧化氢质量摩尔浓度与对照组无明显差异，MDA 质量摩尔浓度显著高于对照组。TK039 在半淹处理下的H2O2含量显著高于对照组而MDA含量无明显差异；全淹处理下H2O2及MDA质量摩尔浓度均显著高于对照组。

图5 淹水处理中TK017 和TK039 叶片的过氧化氢（H2O2）及丙二醛（MDA）质量摩尔浓度Fig.5 Mass molarity of hydrogen peroxide（H2O2）and malondialdehyde（MDA）in leaves of TK017 and TK039 under waterlogging treatment

2.3.5 淹水处理中TK017 和TK039 叶片的过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性

检测TK017 和TK039 在淹水处理2 d 后叶片的POD 活性及SOD 活性。如图6 所示，TK017 和TK039 在半淹处理下，POD 活性与对照组无明显差异，而在全淹处理下，POD 活性均显著高于对照组，且TK017的POD 活性显著低于TK039。TK017和TK039 在半淹及全淹处理下，SOD 活性均显著高于对照组，在全淹处理下，TK017 的SOD 活性显著低于TK039。

图6 淹水处理中TK017 和TK039 叶片中过氧化物酶及超氧化物歧化酶活性Fig.6 Activities of peroxidase and superoxide dismutase of TK017 and TK039 leaves in waterlogging treatment

3 讨论

番茄是喜温植物，现有的番茄品种中多具有抗寒、抗旱和耐高温等抗胁迫能力，但是耐涝能力普遍较低，短时洪涝灾害即可造成番茄严重减产或绝收。

本研究对50个番茄种质幼苗的耐涝能力进行评估筛选。结果显示，7 d半淹处理中50个番茄种质在生理指标上受到一定影响，但是植株均可存活；在更极端的7 d 全淹处理中，番茄种质的表型差异化明显，只有12 个番茄种质的存活率为100%，因此全淹处理更能够快速筛选出幼苗期耐涝性良好的番茄。半淹处理中，虽然50 个番茄种质均全部存活，但是它们在株高、冠幅2 个指标上的表现具有很大差异。在半淹处理中，23 个种质的相对株高大于1.0，13 个种质的相对冠幅大于1.0（见图1），表明半淹条件触发了这些番茄的应激机制使其节间伸长，而另外一些种质的节间伸长机制没有被触发。但是从结果来看，半淹状态下的相对株高和相对冠幅与全淹处理的存活率之间没有相关性，说明节间伸长虽然在一定程度上反应了番茄植株对淹水胁迫的适应机制，但是并不能完全代表植株的耐涝能力。

以往研究表明，在被淹没状态下，植物株高、叶片数量和面积等生物量相关指标均明显低于正常条件；同时由于植株严重缺氧，植物地上部叶片逐渐黄化萎蔫并脱落，地下部分逐渐褐化腐烂，直至整株死亡［28］。与此相似的，在本研究中全淹处理下的绝大部分番茄种质的株高、冠幅和叶绿素含量明显低于正常水平（见图1）。但是仍有个别番茄种质在全淹处理下的株高、冠幅和叶绿素含量与正常水平类似，说明番茄种质间的耐涝能力存在巨大差异。这种差异在全淹条件下番茄幼苗存活率上表现得更为直观（表2）。50 个番茄种质中的32 个为淹水敏感型种质占比64%，其在全淹处理中全部植株死亡；耐涝型番茄种质12个，占比24%，在全淹处理中存活率为100%（表2）。由此可见，在淹没胁迫下，虽然大多数番茄种质耐涝性不佳，但是仍有部分耐涝型番茄可以用于以后的育种工作。同时在本研究中涉及的3类番茄（普通番茄、樱桃番茄和醋栗番茄）均存在耐淹和不耐淹的番茄种质（表2），表明番茄的耐涝能力在种类间没有明显差异。这也为在不同番茄种类中培育耐涝番茄品种提供了一定程度的便利。

为了进一步研究耐涝和不耐涝的番茄种质间的生理差异，本研究挑选了2 种樱桃番茄，耐淹型TK017 和淹水敏感型TK039 进行半淹和全淹处理。结果显示TK017 在半淹处理下的株高和冠幅显著高于对照组，而在全淹处理下的株高和冠幅均显著低于对照组，说明TK017 在半淹处理中节间伸长明显（图2～3），而在全淹处理中其生长受到明显抑制（图2～3）。先前的研究表明，植物遭遇淹水胁迫时，主要有2 种主要策略抵抗胁迫：低氧忍耐策略（LOQS）和低氧逃逸策略（LOES）［7，10］。采用LOQS 策略的植物通过保持最低的能量和碳消耗来延长水下生存时间，从而表现出受限的生长，采用LOES 策略的植物通过保持上部叶片在空气环境中以获得足够的氧气、光和碳［29-30］。从本研究结果来看，TK017 在半淹处理中表型倾向于LOES；在全淹处理中其表型更倾向于LOQS，说明同一植物在不同的胁迫压力下会表现出不同的耐受策略。

长时间的淹水胁迫可导致植物体内有害物质的积累，如ROS 和MDA［31］。本研究中使用DAB 染色法对TK017 和TK039 的叶片进行染色，发现在全淹处理下，耐淹型TK017 的DAB 染色颜色较TK039 浅，即TK017 中ROS 的积累量少于TK039（图4），说明在全淹条件下相对于淹水敏感型的TK039，TK017能够有效地控制细胞内的ROS含量避免ROS 毒性。叶片H2O2含量测定也表明TK039在半淹条件下和全淹条件下均显著高于对照组，而TK017 的H2O2含量虽然在半淹条件下显著高于对照组，在全淹条件下与对照组无明显差异。在逆境条件下植物自身ROS的清除主要通过抗氧化酶（如POD、SOD 等）的活性变化来增强植物抵抗淹水胁迫和其他逆境胁迫的能力［32-33］。本研究中TK017 和TK039 的POD 及SOD 活性在全淹处理组均显著高于对照组，而在同一全淹处理条件下，TK039 的POD 和SOD 活性显著高于TK017，可能是因为全淹处理中TK039 的ROS 含量（图6）的明显升高通过反馈机制激发了POD和SOD活性。说明TK017 在全淹条件下可能激活了某种有效的ROS 平衡机制，从而表现出更强的耐涝性。MDA是细胞膜膜脂过氧化最重要的产物之一且MDA的产生还会加剧细胞膜的损伤［34］。MDA 含量越高，膜脂过氧化程度越高，细胞膜受损程度越严重［28，35］。淹水敏感型TK039 的MDA 含量在半淹处理后与对照组无显著差异，在全淹处理后的MDA含量显著高于对照组；而耐涝型TK017 的叶片MDA 含量在半淹及全淹处理下均显著高于对照组，半淹和全淹处理下的MDA 含量没有明显差异；但是全淹条件下耐涝的TK017 和不耐涝的TK039 的MDA 含量没有明显差异，可能TK017 对高含量MDA 的耐受能力强于TK039，因此能够在全淹条件下存活更久。对于这些猜测的证实，还需要在未来的研究中对TK017 在淹水胁迫下的分子反应机制进行更深入的调查。

致谢感谢黄三文研究员为本研究提供材料支持。