E亚群禽白血病病毒分离株的全基因组序列分析

吴 植，吴 双，袁慧莎，张 聪，朱善元，范红结

（1.南京农业大学，南京 200241；2.江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏现代畜牧与新兽药工程技术中心，泰州 225300）

禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV），又称Rous相关病毒[1]（Rous associated viruses,RAVs），属于逆转录病毒科正逆转录病毒科α逆转录病毒属成员[2]，其基因组结构为5'LTR-5'UTRgag-pol-env-3'UTR-3'LTR，主要引起淋巴白血病、骨硬化病、骨髓成细胞增多症、血管瘤等多种肿瘤性疾病[3-4]，给我国养禽业造成了严重的经济损失，目前尚无有效药物和疫苗可供使用，控制该病最有效的措施是对种鸡核心群开展净化[5-6]。根据独特的感染宿主细胞的受体不同，将ALV分为11个亚群（A-K），其中A～E、J和K亚群均可自然感染鸡群，而F、G、H和I等亚群多见于野生鸟类[7]。感染鸡群的ALV-E亚群通常认为属于内源性病毒，它能够将自身的基因片段整合至宿主细胞的染色体中，以前病毒的形式存在[8]。

尽管我国自2008年起已在鸡群中实施了严格的ALV根除计划，但是由于我国鸡群种类繁杂，A、B、E、J和K等亚群ALV在中国仍然流行且非常严重[9-11]，呈现出多个亚群混合感染、极易发生变异或重组、有效逃避宿主免疫防御、感染宿主不断扩大和致病性更为复杂等特点[12-13]，给禽白血病的防控带来了巨大挑战，因此不断开展ALV的分离鉴定对研究该病的流行情况，基因组变异趋势及种群净化具有重要意义。本研究是在对江苏某地方品种种鸡场进行白血病净化过程中，从无明显临床症状病死鸡组织样品中分离鉴定获得的1株ALV-E，并对其进行了全基因组测序和遗传演变趋势分析，为我国ALV-E分子流行病学调查提供了参考和依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 pMD-19T、PrimeScript™RT reagent Kit（Perfect Real Time）、DL2000购自TaKaRa公司；Viral DNA/RNA Kit DNA/RNA提取试剂盒、2×Taqplus MasterMix凝胶回收试剂盒购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司；E.coliDH5α购自Promega公司；质粒DNA小量提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；ALV p27单克隆抗体由扬州大学兽医学院惠赠；山羊抗小鼠FITC-IgG购自Sigma公司；ALV抗原检测试剂盒购自IDEXX公司；山羊抗小鼠FITC-IgG购自Sigma公司。

1.2 病料与细胞 无明显症状病死鸡的心脏、肝脏、肺脏、肾脏和法氏囊等来源于江苏某一地方品种种鸡场；CEF细胞由SPF级鸡胚按照常规方法制备获得；DF-1细胞由本实验室保存。

1.3 病料的检测 将采集的心脏、肝脏、肺脏、肾脏和法氏囊进行研磨处理，参照Viral DNA/RNA Kit DNA/RNA提取试剂盒说明书进行核酸提取，参照PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒说明书进行反转录，参照GenBank上所公布的序列，设计特异性检测引物用于检测鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia Virus,CIAV）、传染性喉气管炎病毒（laryngotracheitis virus,ILTV）、马立克氏病病毒（Marek's disease virus,MDV）、传染性支气管炎病毒（Influenza B viruses,IBV）、H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus H9 subtype,H9 AIV）、禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV）、网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）和禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV），引物序列见表1，上述引物均由英潍捷基（上海）有限公司合成。

表1 鸡常见传染性病毒病的检测引物Table 1 Primers for detection of common infectious viruses in chicken

1.4 病毒的分离培养 参考文献[14]建立的方法，将PCR初步鉴定为ALV阳性病料研磨上清液分别接种于已将状态调整至最佳且生长密度达70%的CEF细胞和DF-1细胞中，吸附作用3 h后补加含1%血清的DMEM维持液，于37℃、5% CO2培养箱培养7 d后反复冻融2次，离心去除细胞碎片并收集上清液，采用p27抗原检测试剂盒（IDEXX）检测，按照上述方法盲传6代，病毒液于-80℃保存。

1.5 病毒的间接免疫荧光 将P3代CEF细胞培养上清接种到经抗原检测阴性的已长成单层的鸡胚成纤维细胞上，维持7 d后，以ALV p27单克隆抗体为一抗，以山羊抗小鼠FITC-IgG为二抗，利用间接免疫荧光检测病毒在CEF的增殖情况，并设立阳性对照组和阴性对照组。

1.6 前病毒全基因克隆与测序 根据文献[15]合成7对引物扩增禽白血病病毒的全基因组，扩增引物见表2。各段PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳，胶回收产物连入pMD-19T载体，转化E.coliDH5α感受态宿主菌，筛选的阳性克隆送至南京擎科生物技术有限公司测序。

表2 ALV全基因组扩增引物Table 2 Amplification primer of ALV whole genome sequence

1.7 前病毒全基因组序列分析 用DNAStar 7.0/SeqMan软件对分离株各片段序列进行全长拼接；用BioEdit 7.2.6.1软件将分离株与GenBank登录的各亚群ALV参考株进行多序列比对，确定ALV分离株各基因序列；gp85氨基酸序列用MEGA X软件绘制遗传进化树，确定分离株亚群类型。

2 结果

2.1 病料的检测 PCR/RT-PCR检测的结果显示，CAV、ILTV、MDV、IBV、H9 AIV、FAdV、REV均为阴性，ALV扩增结果显示获得了约720 bp的特异性条带，与预期的大小相符（图1），将PCR扩增产物送生工生物工程（上海）有限公司进行测序，结果正确，说明成功扩增目的基因。

图1 病死鸡病料的PCR/RT-PCR扩增结果Fig.1 The identification results of sick materials of dead chickens by PCR/RT-PCR

2.2 p27抗原的检测 盲传6代的DF-1细胞上清液用p27抗原检测试剂盒检测p27抗原，检测结果为阴性，而CEF传代的细胞上清液PCR检测结果为阳性，证实具有传染性病毒粒子存在，且ELISA检测S/P值随着代次增加呈下降趋势，以上结果初步表明该分离毒株为ALV-E，且该病毒在CEF培养中复制能力很弱，将毒株命名为JY202106。

2.3 病毒的IFA鉴定 IFA结果显示，ALV p27单克隆抗体与病毒感染细胞呈阳性反应，被感染细胞的细胞质呈现绿色荧光，而空白对照组并不能激发绿色荧光，表明JY202106株能有效感染CEF细胞（图2）。

图2 JY202106株的IFA检测结果（200×）Fig.2 The IFA results of JY202106 isolate (200×)

2.4 前病毒全基因组序列分析 该分离株分7段扩增了禽白血病病毒的基因组，片段长度分别为2545、1069、808、1202、1106、1075、402 bp（图3）。JY202106分离株经测序之后，用SeqMan软件对测序结果进行拼接，获得该分离株全基因组核苷酸序列。通过拼接之后，结果显示JY202106分离株全病毒基因组全长为7529 bp，与参考株的同源性为84.3%～98.7%。将JY202106分离株与GenBank上已发表的各亚群ALV参考株基因组各片段进行同源性分析。由结果可知，gag和pol基因相对保守，与各亚群ALV参考株同源性95.5%～99.7%，gp37基因亦相对保守，除了ALV-J之外，同源性达91.9%～99.3%，JY202106分离株gp85基因与ev-1分离株同源性最高（99.2%）。位于病毒基因组两端的末端重复序列5'LTR和3'LTR长274 bp，与ALV-E参考株ev-1同源性最高，一致性达99.6%。同时与其他ALV-K参考株（GD14LZ、km-5845）、ALV-A参考株（PDRC-1039）亦有较高的同源性，一致性达97.0%～98.7%（表3）。

图3 JY202106分离株全基因组扩增Fig.3 Whole genome amplification of JY202106 isolate

表3 分离株与各亚群ALV参考株基因组各片段核苷酸同源性比较Table 3 Comparison of homology between the whole genome sequence of JY202106 isolate and the reference strains of ALV subgroup

2.5gp85基因序列分析 分离株JY202106的gp85基因为978 bp，编码326个氨基酸，氨基酸同源性结果分析显示，该分离株与ALV-A参考株同源性为86.1%～86.7%，与ALV-B参考株同源性为85.7%～86.0%，与ALV-C参考株同源性为86.9%～90%，与ALV-D参考株同源性为87.3%，与ALV-K参考株同源性为85.3%～87.4%，与ALV-J参考株同源性仅为49.2%～50.5%，而与ALV-E参考株同源性为98.2%～99.2%，同源性显著高于其他亚群ALV，根据ALV-gp85氨基酸序列亚群鉴定方法，JY202106分离株属于ALV-E。对JY202106分离株与GenBank上的各亚群ALV参考株gp85氨基酸序列进行比对并绘制遗传进化树可知，JY202106分离株与ev-1、ev-3、RAV-0、SDO5O1等归类为ALV-E的参考株属于同一分支，而有别于其他亚群参考株，进一步验证了其亚群分类属于ALV-E，其与SDO5O1株gp85氨基酸序列遗传关系最为密切（图4）。

图4 JY202106分离株与ALV各亚群参考株gp85序列进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of gp85 sequence of JY202106 isolates and reference strains of ALV subgroups

3 讨论

ALV可以引起一定比例鸡群产生不同程度的肿瘤，但是大多数感染鸡仅表现亚临床感染，出现一定程度的免疫抑制、产蛋下降。20世纪90年代以来，国内的白羽肉鸡、黄玉肉鸡蛋鸡先后遭受了白血病危害，造成巨大损失，此病还具有向中国其他品系鸡蔓延的趋势[16]。ALV从鸡群中分离到的只有A、B、C、D、E和J 6个亚群。其中E亚群是内源性的，即其前病毒cDNA存在于大多数鸡群的染色体基因组中，有的能从染色体基因组产生完整的病毒粒子或者仅表达某些蛋白质，通常内源性白血病没有致病性或者致病性很低，但是会干扰外源性ALV的检测。

本研究对江苏某鸡场送检病料进行了白血病病毒检测，分离鉴定出1株内源性ALV，命名为JY202106。经过全基因组测序，发现其具有完整的基因组，对其进行了系统进化分析，结果表明，该分离株全长7529 bp，gag、pol基因保守性较高，二者与ALV其他亚群间核苷酸同源性均在95.5%以上，而gp85基因与E亚群参考毒株的同源性显著高于其他亚群，在遗传进化分析上与E亚群参考株隶属于同一分支，进一步表明该分离株为E亚群ALV。分离株JY202106 5'LTR基因核苷酸序列与K亚群分离株TW-3593、GD14LZ同源性高达98.2%，猜测此分离株有可能与ALV-K分离株TW-3593、GD14LZ有共同祖先。LTR启动活性的强弱与ALV致瘤的强弱密切相关，而内源性病毒的致瘤作用很弱，JY202106分离株与ALV内源性毒株ev-1、SDO5O1、AF227株的LTR核苷酸序列同源性达98%以上，而与其他亚群的同源性相对较小，据此推测，本研究分离株的致瘤作用可能也很弱。

众所周知，内源性ALV-E既会影响外源性ALV感染，同时也能影响疾病进程及宿主正常的生理活动。据报道，具有转录活性的ALV-E能够导致某些重要经济特征的降低，例如产蛋量和蛋重。本研究通过将病料研磨液接种DF-1及SPF鸡胚来源的CEF，结果显示在对内源性病毒有抵抗的DF-1细胞无病毒复制，而能在ALV各亚群均能生长的CEF上p27检测阳性，显示有病毒感染CEF，且该病毒携带具有传染性的病毒粒子，但仅仅是内源性的ALV-E。本研究不足以证明该毒株能诱导鸡群肿瘤的产生，这可能与鸡群体内载毒量有关，当病毒复制到一定水平时，动物就会发病。ALV净化对养殖场来说是非常必要的，临床上ALV-E分离越来越常见，因此在生产中应引起足够的重视。本研究通过RT-PCR检测和序列比对，确定送检病鸡中存在ALV-E亚型感染，表明江苏某鸡场内存在内源性ALV感染，内源性ALV对鸡来说不是必须的，能否通过某些技术（基因编辑）培育出无内源性ALV基因的鸡品种还需要进一步来验证。