柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼营养代谢的影响

魏奇，黎鑫，杨菲，周逢芳，黄伟卿，陈美霞，刘伟,3

（1.宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；3.福建省科技厅产学研合作示范基地，福建 宁德 352100；4.闽东水产品精深加工福建省高校工程研究中心，福建 宁德 352100）

大黄鱼（Larimichthys crocea）又名黄瓜鱼，两侧和腹侧呈金黄色，肉质鲜嫩且富含蛋白质，深受广大消费者的喜爱[1,2]。目前，大黄鱼多以集约化网箱养殖为主。网箱养殖的大黄鱼活动空间受限，养殖密度大，活动量少，饲料中脂肪含量过高，人工养殖的大黄鱼鱼肉品质降低于野生大黄鱼[3]。已有研究表明，改变养殖模式或在饲料中添加天然植物提取物能提高水生动物的存活率，改善其肌肉品质[4,5]。邓超准等[6]研究表明，在饲料中加入原花青素能够促进星洲红鱼（Singapore red tilapia,O.mossambicus）的生长。天然植物提取物具有绿色、安全和效果稳定等特点，作为饲料添加剂能够提高水生动物饲料的营养价值。因此，天然植物提取物作为饲料添加剂受到了水产养殖业的广泛关注[7,8]。

柳叶蜡梅（Chimonanthus salicifolius）是畲族民间常用的药用和保健两用植物，其主要活性成分为挥发油、香豆素和黄酮等。已有研究表明，柳叶蜡梅具有止泻，清热解毒，抗氧化，抗肿瘤，免疫调节和保护肝脏等多种药理作用[9-12]。柳叶蜡梅的鲜叶可以加工成风味茶，用于冲泡饮用。目前，关于柳叶蜡梅作为大黄鱼的饲料添加剂的研究较少。邹永等[13]研究表明，在大黄鱼的饲料中加入柳叶蜡梅醇提物可以有效改善大黄鱼的肌肉品质，促进大黄鱼对营养物质的吸收。然而，关于柳叶蜡梅对大黄鱼营养物质消化和糖脂代谢的研究较少。本研究通过给大黄鱼投喂含有0%、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%柳叶蜡梅醇提物的饲料，以探究柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼消化酶和营养物质代谢酶活性的影响，并为大黄鱼的科学养殖提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

柳叶蜡梅由福瑞泰生物技术有限责任公司提供。试验鱼购买于宁德市鼎诚水产有限公司。

试剂：4%多聚甲醛，生工生物工程（上海）股份有限公司；伊红染液、苏木素，北京索莱宝科技有限公司；戊二醛、中性树胶，美国Sigma-Aldrich 公司。胃蛋白酶测定试剂盒、总蛋白定量测定试剂盒、丙二醛（MAD）测定试剂盒、苹果酸脱氢酶（ME）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）测定试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、己糖激酶（HK）测定试剂盒、丙酮酸激酶（PK）测定试剂盒、肉毒碱棕榈酰转移酶1试剂盒（CPT-1）、激素敏感脂肪酶试剂盒（HSL）、脂肪酸合成酶试剂盒（FAS）、α 淀粉酶测试盒和脂肪酶（LPS）测定试剂盒，南京建成科技有限公司。

仪器与设备：BSA224S 电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DK-98-II 电子恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；3-16KL 型高速冷冻离心机，德国Sigma 公司；HistoCore Biocut R 切片机、M199 切片刀，德国徕卡公司；BA210T 显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；Varioskan LUX 酶标仪，美国Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 柳叶蜡梅提取物的制备

柳叶蜡梅叶片置于65 ℃鼓风干燥箱中干燥10 h。采用中药粉碎机粉碎干燥的柳叶蜡梅叶片（0.15 mm）。称取1 kg 柳叶蜡梅粉末，以料液比1∶30 的比例加入85%的乙醇，于70 ℃条件下进行热回流提取3 h。滤液经45 ℃旋转蒸发和冷冻干燥，即得柳叶蜡梅醇提取物。

1.2.2 饲料的制备

基础饲料为“海马”牌大黄鱼人工配合饲料，含粗脂肪6%，粗蛋白45%，粗灰分14%，粗纤维5%，氯化钠0.5%～3%，赖氨酸2.8%，钙1%～3%，总磷1%，水分10%。将基础饲料粉碎后加入柳叶蜡梅醇提物（0%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%），拌匀后过60 目筛，用饲料制粒机加工成试验饲料（3 mm），干燥避光保存。

1.2.3 分组及饲养管理

养殖试验于宁德师范学院国家海洋局海西海洋生物种质资源及生物制品开放利用公共服务平台养殖基地进行。养殖池长（4 m）×宽（2 m）×高（2.5 m）。健康大黄鱼在水体溶氧5 mg·L-1以上、水温15 ℃～25 ℃、盐度24.2～27.7 和pH7.92～8.23 的条件下适应性养殖两周。健康大黄鱼的平均体质量为（10.31±2.88）g，平均体长为（10.21±0.81）cm。将500 尾大黄鱼随机分为5 组，每组100 尾，按大黄鱼体质量的2%～3%投喂饲料，养殖8 周。饲料中柳叶蜡梅醇提物的添加量分别为0%（对照组，L-0）、0.5%（L-0.5）、1%（L-1）、2%（L-2）和4%（L-4）。

1.2.4 采样与测定

8 周后，大黄鱼经停食处理24 h。每组随机选取10 尾大黄鱼，冰盘解剖取大黄鱼肝脏、胃、肠道和右侧背部肌肉组织，备用。

消化道中营养物质酶活测定：称取大黄鱼胃和肠道样品100 mg，加入0.9 mL 磷酸缓冲盐溶液，匀浆和离心处理后，取上清液备用。根据试剂盒说明书测定样品的总蛋白浓度、α 淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性。

营养代谢相关酶活及抗氧化指标测定：大黄鱼肝脏中丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（ME）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）、脂蛋白脂酶（LPL）、脂肪酸合成酶（FAS）、激素敏感脂肪酶（HSL）、肉毒碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、总超氧化物歧化酶（SOD）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）和丙二醛（MDA）等指标采用南京建成生物工程研究所试剂盒的方法测定。大黄鱼肌肉组织中测定TG、TC、HDL-C、LDL-C、MDA和SOD。

肌肉微观结构观察：取大黄鱼背肌样品（1 mm3），置于戊二醛中固定，然后经生理盐水清洗后，经固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色处理。采用透射电镜观察大黄鱼肌肉的微观结构。

1.3 数据处理

每个试验重复测定3 次，取其平均值。应用SPSS 23 进行单因素方差分析，差异显著用Duncan’s 多重比较进行，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼消化酶的影响

柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼肝脏和消化道中消化酶活性的影响如表1 所示。由表1 可知，L-4 组中大黄鱼肝脏、肠道和胃中的α 淀粉酶的活性显著高于对照组（P＜0.05）；肝脏和肠道中的脂肪酶活性显著高于对照组（P＜0.05）；肝和胃中的蛋白酶活性显著高于对照组（P＜0.05）。4%的柳叶蜡梅醇提物能有效提高大黄鱼肝脏和消化道内的α 淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性，促进大黄鱼对饲料中营养物质的吸收利用。

表1 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼消化酶的影响Tab.1 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on activities of the digestive enzymes of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.2 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼糖代谢的影响

柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼糖代谢的影响见表2。由表2 可知，对照组和试验组中柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼肝脏组织中G6PDH、LDH、ME 和PK 的活性影响显著（P＜0.05）。L-4 组大黄鱼肝中LDH 和PK 的活性显著高于对照组（P＜0.05）。L-4 组的G6PDH 和ME 的活性显著低于对照组（P＜0.05）。L-1 组、L-2 组和L-4 组大黄鱼肝脏组织中的HK活性与对照组差异不显著（P＞0.05）。

2.3 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼TG、TC、HDL-C和LDL-C 的影响

柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼肝脏和肌肉中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 的影响如表3 所示。柳叶蜡梅醇提物能降低大黄鱼肝脏和肌肉中的TG、TC 和LDL-C 含量；且HDL-C 含量高于对照组。试验组L-1、L-2 和L-4 中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 的含量没有显著性差异（P＞0.05）。由此可知，添加4%柳叶蜡梅醇提物能够降低大黄鱼肝脏和肌肉中TG 和TC 的含量，改善大黄鱼体内脂质堆积。

表3 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼TG、TC、HDL-C 和LDL-C 的影响Tab.3 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on the values of TG,TG,HDL-C,and LDL-C of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.4 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼脂质代谢酶的影响

柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼脂质代谢酶活性的影响见表4。柳叶蜡梅醇提物能调控大黄鱼肝脏组织中脂质代谢酶（FAS、CPT-1、HSL 和LPL）的活性。L-4 组大黄鱼肝脏组织中FAS 的活性显著低于对照组（P＜0.05）；L-0.5 组、L-1 组和L-2 组中的FAS酶活性差异不显著（P＞0.05）。L-4 组的CPT-1、HSL和LPL 酶的活性均显著高于对照组（P＜0.05）。由此可知，4%柳叶蜡梅醇提物作为饲料添加剂能有效促进大黄鱼体内脂肪分解，抑制脂肪合成，降低大黄鱼体内脂肪的含量。

表4 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼肝脏中脂质代谢酶活性的影响Tab.4 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on activities of lipid metabolism enzymes in liver of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.5 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼抗氧化活性的影响

柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼体内抗氧化活性的影响见表5。L-4 组大黄鱼肝脏中SOD 酶的活性显著高于对照组（P＜0.05），而MDA 含量则显著低于对照组（P＜0.05）。L-0.5 组、L-1 组和L-2 组肌肉中SOD 的活性高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。L-0.5 组、L-1 组和L-2 组肌肉中MDA 的含量低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。由此可知，柳叶蜡梅醇提物作为大黄鱼饲料添加剂能够提高大黄鱼肝脏中SOD 酶的活性，降低大黄鱼肝脏中MDA 的含量，提高大黄鱼肝脏的抗氧化能力。

表5 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼抗氧化活性的影响Tab.5 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on antioxidant activity of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.6 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼肌纤维超微结构的影响

柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼肌纤维超微结构的影响见表6 和图1。观察发现，对照组大黄鱼肌肉纵切面的肌节长度小于L-1 组、L-2 组和L-4 组（P＜0.05）。由图1 可知，对照组的肌纤维纹理较不清晰，排列不整齐。L-2 组和L-4 组的肌节长度和明带长度显著高于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，试验组L-4 的肌纤维排列整齐，明带暗带纹理更加清晰。

图1 大黄鱼肌肉透射电镜图Fig.1 Transmission electron microscope in muscle tissues of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

表6 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼肌肉超微结构的影响Tab.6 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on ultrastructure of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

3 讨论

3.1 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼消化道中消化酶的影响

天然植物提取物能有效促进鱼类生长、提高存活率和改善鱼肉品质，能维持和改善水域的生态平衡，已被广泛用于水生动物养殖研究。在饲料中添加天然植物提取物能够有效促进大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）[14]、小龙虾（Procambarus clarkii）[15]、大黄鱼[16]和鲤（Cyprinus carpio）[17]等水生动物的生长，增强其抗病能力。肠道是水生动物吸收营养物质的主要场所。邓超准[6]研究发现，将原花青素添加到星洲红鱼饲料中能够有效提高星洲红鱼肠和胃中的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力。刘淑兰等[18]研究发现，槐属植物黄酮添加到饲料中，能够提高罗非鱼（Oreochromis niloticus）胃部和肠道中消化酶活性。该研究结果与本研究结果相一致。本研究发现，4%的柳叶蜡梅醇提物作为大黄鱼的饲料添加剂能够提高大黄鱼肝脏、肠道、胃部中α 淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性，促进大黄鱼对营养物质的吸收。由此可知，柳叶蜡梅醇提物作为大黄鱼饲料添加剂对大黄鱼消化道消化酶的分泌具有促进作用。

3.2 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼糖代谢的影响

肝脏是大黄鱼糖代谢的重要器官，主要通过糖酵解和糖异生的作用调控血糖含量。糖酵解反应能分解鱼体葡萄糖，为机体提供能量。PK 和HK 含量越高，糖酵解为鱼体提供的能量越多。G-6-PDH 使6 磷酸葡萄糖脱氢产生NADPH，ME 能分解苹果酸，产生NADPH。NADPH 是FAS 的主要能量来源，G-6-PDH 和ME 的减少会导致NADPH 含量减少，减少脂肪的合成效率[19,20]。本研究结果表明，在大黄鱼饲料中添加4%的柳叶蜡梅醇提物，能够显著提高大黄鱼肝脏组织中PK 和LHD 酶的活性（P＜0.05），显著降低G-6PDH 和ME 酶的活性（P＜0.05）。由此可知，柳叶蜡梅醇提物能够提高大黄鱼的体内糖酵解水平，为大黄鱼活动提供更多的能量，降低NADPH 的产生，降低脂肪在大黄鱼体内的合成和堆积。

3.3 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼脂质代谢的影响

TG、TC、LDL-C 和HDL-C 能够反映机体脂质代谢的情况[21]。TG 和TC 含量过高，可导致血液黏稠，使脂质在血管壁上沉积，危害机体。HDL-C 能将血液中的胆固醇运输到肝脏分解成胆酸盐，降低胆固醇含量。LDL-C 通过将肝脏中的胆固醇运输到血液，提高血脂的水平，阻碍物质在血液中的运输效率。已有大量的研究表明，植物提取物作为饲料添加剂能够降低水生动物体内脂肪堆积。Zhai 等[22]研究发现，将槲皮素制备成罗非鱼饲料，能减低罗非鱼体内TG 和LDL-C 含量，提高HDL-C 含量。苟庚午等[23]研究发现，将飞蓟素添加到饲料中能够有效调节罗非鱼的脂质代谢，显著提高罗非鱼肝脏中LPL 和总脂肪酶的活性（P＜0.05）。由此可知，饲料中添加飞蓟素能够有效减少罗非鱼肝脏中的脂质沉积，提高罗非鱼脂质的利用率[23]。以上的研究结果与本研究结果一致。本研究发现，以4%的柳叶蜡梅醇提物作为大黄鱼的饲料添加剂能够显著提高大黄鱼脂肪分解酶（HSL、CPT-1 和LPL）的活性和HDL-C 含量，显著降低ME、G-6-PDH、FAS 和MDA 酶的活性和TG、TC、LDL-C 含量。由此可推断，柳叶蜡梅醇提物能降低大黄鱼G-6-PDH 和ME酶活性和NADPH 含量，导致脂肪的合成效率下降，促进大黄鱼体内脂肪的分解。LPL 活性的增加还能提高大黄鱼脂肪的利用率。LDH 含量的增加，表明大黄鱼的无氧代谢水平也有所提高。由此可知，柳叶蜡梅通过改善脂质代谢水平和增加脂肪的利用率来降低体内脂质的含量。

3.4 柳叶蜡梅醇提物对大黄鱼抗氧化活性的影响

SOD 能够有效抑制机体氧化作用，对体内超氧化物的自由基具有清除作用[24]。MDA 是评判脂质过氧化的重要指标[25]。本研究用SOD 和MDA 评估柳叶蜡梅醇提物提高大黄鱼体内抗氧化的能力。本研究结果显示，4%的柳叶蜡梅醇提物作为大黄鱼的饲料添加剂能显著提高大黄鱼肝脏组织中的SOD 活性，降低其MDA 含量（P＜0.05），由此可知，柳叶蜡梅醇提物能够增强大黄鱼体内的抗氧化作用。抗氧化活性的提高也间接改善了大黄鱼肝脏的健康状况和营养物质代谢过程。

综上所述，柳叶蜡梅醇提物能够改善大黄鱼肠道对营养物质消化吸收作用，改善大黄鱼糖代谢和脂质代谢。因此，柳叶蜡梅醇提物作为饲料添加剂能够为绿色、新型的大黄鱼饲料的开发提供新的思路。