eNOS基因单倍型与冠心病的关联性分析

王晓焕,尹昭,曹鸿鹍

2015年数据显示,全球每年有超过1 700万人死于心血管疾病,为主要的死亡原因之一,部分国家心血管疾病的死亡人数远超癌症死亡人数,而冠心病(CAD)在心血管疾病中所占比例较大[1]。有研究[2]表明,高血压、吸烟、肥胖、糖尿病及胆固醇升高为CAD预测因子。近年来研究[3-4]提示,遗传因素在CAD发病中所起作用占20%～60%,多数常见的基因变异可能与CAD的发生、发展相关[3-4]。挥发性分子一氧化氮(nitric oxide,NO)由L-精氨酸通过神经元NO合成酶、诱导型NO合成酶及内皮NO合成酶(eNOS)催化合成[5]。NO为生理过程的主要第二信使,对维持血管张力和血压起着关键作用[5]。推测eNOS基因可能参与CAD发病。eNOS基因存在许多变异,包括编码序列、5'侧翼区及内含子多态性。关于eNOS基因多态性与CAD的关联性研究多集中于第7外显子中的G894T(rs1799983),该变异由Glu-Asp替代(Glu298Asp)引发[6]。尽管多项研究[7-20]报道了eNOS基因多态性(包括G894T)与CAD发生的关联性,但结果存在争议。本研究旨在探索云南汉族人群eNOS基因Tag SNPs与CAD发生发展的潜在关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012—2015年云南省第二人民医院收治的云南汉族冠心病患者514名作为冠心病组。纳入标准:均接受标准化冠状动脉造影术,一支或多支主要冠状动脉直径狭窄≥50%;由至少两位心脏病专家诊断。另选取同期云南省第二人民医院健康体检中心体检排除CAD的云南汉族健康体检者198名作为对照组。所有受试者均获得知情同意,研究经云南省第二人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 收集2组受试者外周静脉血3 mL,放于含有EDTA二钠作为抗凝剂的试管。用酚氯仿法提取外周血淋巴细胞基因组DNA。所有DNA样品均溶于不含DNA酶的水中,保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 基因分型 在HapMap-CHB数据库中,选择MAF>10%(http://www.hapmap.org/)SNP,采用HaploView软件包基于连锁不平衡(r2≥0.8)筛选获得eNOS基因的6个Tag SNP(rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186、rs7830)作为遗传标记。采用MALDI-TOF-MS方法,以表1所示的序列为扩增引物和延伸引物,使用SEQUENOM质量阵列系统对SNP进行基因分型。

表1 eNOS单核苷酸多态性引物

2 结果

2.1 2组受试者一般资料比较 冠心病组年龄、BMI、TC、TG、HDL-C及LDL-C水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2组间性别、收缩压及舒张压比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组受试者一般资料比较

2.2 2组受试者eNOS Tag SNP基因型分布比较 对照组人群基因分型均符合HWE(哈德温平衡)。2组受试者eNOS Tag SNP基因型和等位基因分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3,表4。多变量Logistic回归分析结果显示,矫正年龄、性别、BMI、血脂、血压后,rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186及rs78306个eNOSTag SNP基因型和等位基因分布与CAD发病无关(P>0.05)。见表5。

表3 2组受试者基因型分布比较

表4 2组受试者等位基因分布比较

表5 eNOS Tag SNP显性、共显性模型与CAD发病的Logistic回归分析

2.3 eNOS Tag SNP单倍型与CAD发病的多因素Logistic回归分析 对6个eNOS Tag SNP(rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186及rs7830)构建单倍型,排除MAF频率<0.001的单倍型后共建立24个单倍型。多因素Logistic回归分析结果显示,Hap1、Hap2、Hap3、Hap4、Hap5、Hap6、Hap7、Hap8、Hap9及Hap10单倍型均与CAD发病风险无关(P>0.05)。其余14个单倍型个数小于1,未做分析。见表6。

3 讨论

心血管疾病人群发病率高,全球范围内医疗负担重[21]。CAD作为心血管疾病占比较大的疾病,其发生、发展受遗传和环境因素的综合作用。研究[3-4]表明,遗传因素参与了CAD发病。尽管有研究[22]探索了遗传因素与CAD的关联性,但可能因研究对象存在种族差异等原因,研究结果不尽相同[23]。

血管内皮对维持血管完整性起着重要作用,内皮功能障碍在动脉粥样硬化和其他心血管疾病发病机制中起着重要作用,可增加心血管不良事件的发生风险[24]。动脉粥样硬化患者体内存在促氧化和抗氧化失衡[25]。NO是由血管内皮细胞释放,其可调节血管舒缩张力。动脉粥样硬化与内皮功能障碍和 NO生物利用度降低有关[26]。内皮源性NO是由eNOS催化产生,可抑制血小板聚集,减少白细胞与血管内皮的粘附[27]。NO减少与血管功能障碍有关[25]。人eNOS基因位于第7号染色体上,由26个外显子组成,约21kb[28]。关于eNOS基因多态性与CAD相关性报道多集中于第7外显子中的G894T(rs1799983)[7]。G894T(rs1799983)变异为谷氨酸在基因298位点(Glu298Asp)上发生变异,对应的eNOS区域易被eNOS酶裂解[29], G894T可能影响血浆NO水平[30],参与CAD发病。但关于eNOS-G894T多态性与CAD发病机制的关联性研究结论不一致[11, 13-19, 31]。eNOS-G894T基因多态性与延边地区老年CHD和心肌梗死(MI)发病可能相关,T等位基因可能为易感基因[32];而在韩国人群中未发现G894T与CAD发病的相关性[10]。有研究[29-33]报道了eNOS-T786C和4a4b多态性与CAD发病风险的相关性;针对中国汉族人群的研究[31]发现,eNOS多态性rs1799983和rs20707744可能与CAD的发病相关。巴基斯坦一项研究[11]表明,rs1799983与冠状动脉疾病相关。关于eNOS基因多态性与CAD发病风险的研究结果也不一致[7, 9-19, 31, 34-35],2者间的相关性仍有待进一步验证[36]。本研究评估了6个eNOS Tag SNP(rs1800783,rs1799983,rs743507,rs3918184,rs3918186、rs7830)与CAD间的潜在关联。结果显示,2组间6个eNOS Tag SNP基因型、等位基因分布均无差异,多因素分析也显示,在校正年龄、性别、BMI、血脂、血压后,eNOS Tag SNP基因型和单倍型均与CAD发病无关。这与之前部分研究[31-32]结果得出的rs1799983与CAD关联性的结论不一致。可能与种族差异、样本量不足有关。rs1800783,rs743507,rs3918184,rs3918186、rs7830与CAD的关联性为本研究首次探索,结论亦可能存在种族差异、样本量不足等因素影响。本研究还存在一些不足:(1)样本来源于医院病人,可能存在选择偏倚;(2)2组年龄、体质量指数、甘油三酯及低密度脂蛋白不匹配,可能存在混杂偏移。CAD是多基因病,可能存在其它与CAD发病相关的基因变异。尽管有GWAS研究[37]显示,eNOS/NO通路参与了CAD的发生、发展,但同一位点基因变异仍需要深入研究。

综上所述,本研究尚不支持在云南汉族人群中eNOS多态性、单倍型与冠心病发病风险的关联性。