不同浓度的乙醇层析液在生物化学氨基移换实验中的运用探究①

吴志鹏,林丽彬,柯益彬,韩丽红 (莆田学院基础医学院生物化学与细胞生物学教研室,福建 莆田 351100)

纸层析法肝脏组织氨基移换实验是生物化学实验课程中常见的一个实验。传统的实验过程所用的层析液是苯酚。但苯酚对黏膜、皮肤具有较强的腐蚀作用。苯酚还可抑制中枢神经损伤肝脏和肾脏,同时苯酚易挥发会散发出非常难闻的气味,特别是在一个实验室里有多人用苯酚进行纸层析时,对学生的身体健康会有不好的影响。近年来,有不少学者为了优化本实验进行了一些有益的尝试。比如游云悠等[1]比较不同的缓冲液类型、转氨基时间等对转氨基的影响。刘美艳、陈舒丽、陈刚等[2～4]也对氨基酸纸层析实验的改进进行了初步研究。本文探索用低毒且气味小的乙醇溶液代替苯酚作为层析液,在纸层析法肝脏组织氨基移换实验中的运用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜动物肝脏,水浴锅,匀浆器,喷雾器,电吹风机,点样毛细管,表面皿,圆型滤纸,镊子,直尺,圆规等。0.1mol/L丙氨酸,0.1mol/L谷氨酸,0.1mol/L α-酮戊二酸,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液,0.5%茚三酮溶液,70%～90%乙醇层析溶液,苯酚层析溶液(水饱和苯酚溶液)。

1.2 方法

转氨酶液的制备和氨基移换反应:用常规方法进行转氨酶液的制备,氨基移换反应中对照管中的酶经过沸水浴灭活,测定管中的酶一直在37℃水浴锅中保持较大活性。对照管和测定管同时加入1.5mL的0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液和反应底物0.5mL的0.1mol/Lα-酮戊二酸、0.5mL的0.1mol/L丙氨酸溶液。

配制70%～90%乙醇层析溶液:用95%的乙醇溶液加蒸馏水分别配制70%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、90%的乙醇溶液各500mL这3种不同浓度的乙醇溶液各加入2.5g的尿素和0.5g的茚三酮最终配制成70%～90%乙醇层析溶液。

苯酚层析和70%～90%乙醇层析:取4张干净平整的圆滤纸,先用圆规从圆滤纸中心画上半径为1cm的圆,再用铅笔如下图1所示作三条过圆心的直虚线与同心圆相交的6个点,分别标记1～6作为点样原点。用滤纸做引流的灯芯插在圆心处如图2层析装置示意图所示。取干净的毛细玻璃管在标记1处点样原点小心点上少量0.1mol/L丙氨酸标准液,用另一根干净的毛细玻璃管在标记4处点样原点小心点上少量0.1mol/L谷氨酸标准液。同样在2、6两处点样原点均小心点上少量的测定管过滤液,在3、5两处点样原点均小心点上少量对照管过滤液。1张圆滤纸上完样品后用苯酚层析,另外3张圆滤纸上完样品后分别用70%乙醇层析液、80%乙醇层析液、90%乙醇层析液层析。这四张圆滤纸对应各点上的点样量一致。乙醇层析时间为35min,苯酚层析时间为45min。

图1 圆滤纸上的六个点样原点

图2 层析装置示意图

显色和Rf值计算:层析一旦结束立刻用铅笔标记各圆滤纸溶剂前沿位置。苯酚层析的圆滤纸先小心用吹风机吹干,吹干后再用喷雾器均匀喷撒0.5%茚三酮溶液,把吹风机调到热风状态,对已经喷撒茚三酮溶液圆滤纸吹干显色。70%～90%乙醇层析的3张圆滤纸,因为乙醇层析溶液里面提前溶解茚三酮,直接用吹风机在加热状态下吹干显色。确定各色斑中心并按下列计算Rf值公式统计各斑点氨基酸的Rf值(Rf=色斑中心至点样原点的距离/溶剂前沿至点样原点的距离)。

2 结果

2.1 苯酚作为层析液分离鉴定氨基酸

苯酚作为层析液分离鉴定氨基酸显色结果如图3所示。图3中1处和4处分别显示标准丙氨酸和的标准谷氨酸的色斑,它们作为特定氨基酸的判断依据。图3中2处和6处是测定管样品层析结果,因为转氨酶(ALT)有活性,转氨酶会把反应底物中部分丙氨酸的氨基转移给a一酮戊二酸从而生成了谷氨酸。由于丙氨酸过量,因此图中2处和6处都有丙氨酸和谷氨酸的两个色斑。图3中3处和5处是对照管样品层析结果,由于其转氨酶被灭活,没有谷氨酸生成。故都只有一个丙氨酸的色斑。

图3 苯酚作为层析液分离图谱

2.2 70%～90%乙醇层析液分离鉴定氨基酸

70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇作为层析液分离鉴定氨基酸显色结果分别如图4～6所示。图中各处显示色斑的意义和原理与图3一样。

图4 70%乙醇层析图谱

2.3 苯酚和80%乙醇层析液层析图片Rf值计算结果

确定个色斑中心后再用直尺分别量出图3和图5中从点样原点到层析色斑中心的距离(x),以及从点样原点到溶剂前沿的距离(y),计算各样品的Rf值(Rf=x/y)。

表1 苯酚层析分离鉴定图3各氨基酸的Rf值(x、y单位cm)

表2 80%乙醇层析分离鉴定图5各氨基酸的Rf值(x、y单位cm)

图5 80%乙醇层析图谱

3 讨论

纸层析法肝脏组织氨基移换实验是生物化学实验课程中常见的一个实验。同时不断改进的纸层析法也用于分离油菜籽中脂肪酸、大豆磷脂的分析与检测以及甲基营养菌5222产L-丝氨酸等[5～8]。

对比图4图5和图6,在点样量和层析时间相同的前提下, 80%乙醇层析图谱(图5)效果最好。纸层析是以滤纸为支持物,与滤纸纤维结合的水为固定相,参与层析的有机溶剂作为流动相。在图4图5和图6的实验中,有机溶剂分别是70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液。由于乙醇溶液浓度不一样,相应的水浓度也不一样。要形成较稳定的固定相需要合适的水浓度与滤纸纤维进行有效结合。较稳定的固定相有利于不同氨基酸的层析分离。实验表明80%乙醇溶液是比较合适层析液,其层析的图谱比70%乙醇溶液和90%乙醇溶液乙醇溶液得到的图谱更加清晰,色斑更加集中,更有利于下一步各色斑Rf值计算。乙醇溶液中添加少量的尿素,尿素可以增强滤纸纤维素吸附水的能力,有利于不同氨基酸的纸层析分离。

图6 90%乙醇层析图谱

通过比较图3和图5中标准氨基酸色斑Rf值与对照组和实验组中的相应色斑Rf值对应关系,当两者Rf值相等时,可判断对照组和实验组中的相应色斑与标准氨基酸一样。在以苯酚作为层析液实验中,丙氨酸的Rf值是0.64,谷氨酸的Rf值是0.34,因此可以判定对照组和实验组中的色斑所代表的氨基酸与标准氨基酸一致。在以80%乙醇作为层析液实验中,丙氨酸的Rf值是0.61,谷氨酸的Rf值是0.38,因此也可以判定对照组和实验组中的色斑所代表的氨基酸与标准氨基酸一致。实验结果表明在进行肝脏组织氨基移换作用实验中,80%乙醇溶液作为新型层析液与传统的苯酚作为层析液试验结果具有相同的可靠性。需要说明的是,由于苯酚和乙醇是两种不同的层析液,故同一种氨基酸其Rf值在不同层析液中是有所差异的。

80%乙醇溶液中还直接添加了茚三酮,故层析一旦结束,可以直接用吹风机在加热状态下吹干显色。而苯酚层析后,需把圆滤纸先小心用吹风机吹干,吹干后再用喷雾器均匀喷撒0.5%茚三酮溶液,再用吹风机在加热状态下吹干显色。前者步骤更简便,所用器材也少。因此可以节约成本和缩短实验时间。关键是乙醇层析液相比于苯酚层析液具有低毒环保优点。