TLR4和肠道菌群在原发性肝癌进展中动态变化及与其预后的关系

李 慧 康纯嘉 董赛男 张心敏

原发性肝癌致病原因复杂多样,随着病情进展,可对患者生命安全构成威胁[1]。相关研究表明,原发性肝癌与乙型肝炎病毒(HBV)感染及其诱发的相关炎症反应等存在密切联系,肝病患者存在小肠细菌过度生长情况[2-3]。因肝病患者多伴有肝功能障碍,机体内肠黏膜通透性增加、白蛋白及酶类生成量减少、肝脏对内毒素清除能力的减弱,使得肠腔内大量的外来致病菌长时间的停滞,结肠菌群不断上移,小肠腔内毒素聚集后增多,致使受损肠黏膜释放入血后形成肠源性内毒素血症[4-5]。Toll-样受体4(TLR4)属TLR家族,为Ⅰ型跨膜蛋白受体,可识别病原微生物分值的病原相关分子模式(PAMPs),相互作用可启动TLR4信号转导途径后发挥其效应。TLR4还可通过特异性识别PAMPs并与其相结合后启动TLR4信号传导途径,最终诱发免疫炎症反应,导致肝癌患者病情进展[6-7]。目前,临床关于肠道菌群与TLR4在原发性肝癌进展中的研究较少。对此,本研究回顾性分析2019年2月至2021年6月于我院就诊的肝脏疾病患者120例的临床资料,分析TLR4和肠道菌群在原发性肝癌进展中动态变化,旨在探究其与预后的关系,旨在为原发性肝癌的预防及治疗提供新思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2019年2月至2021年6月于我院就诊的肝脏疾病患者120例的临床资料,其中40例肝硬化合并乙型肝炎患者纳入肝硬化组,50例慢性乙型肝炎患者纳入肝炎组,30例肝癌患者纳入肝癌组。肝硬化组男性27例,女性13例;年龄34～68岁,平均年龄(50.86±5.91)岁;体质量指数为20.6～26.8 kg/m2,平均体质量指数为(23.71±1.13)kg/m2。肝炎组男性33例,女性17例;年龄34～69岁,平均年龄(50.79±5.88)岁;体质量指数为20.8～26.7 kg/m2,平均体质量指数为(23.66±1.08)kg/m2。肝癌组男性20例,女性10例;年龄35～70岁,平均年龄(51.02±6.01)岁;体质量指数为20.5～26.8 kg/m2,平均体质量指数为(23.72±1.20)kg/m2。对照组为我院同期行健康体检的100例志愿者,其中男性62例,女性38例;年龄34～69岁,平均年龄(50.82±5.95)岁;体质量指数为20.6～27.0 kg/m2,平均体质量指数为(23.80±1.09)kg/m2。四组一般资料对比,差异无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。

1.2 入选标准

纳入标准:肝癌患者TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期,均行根治性手术;患者及家属均知情同意本次研究。排除标准:伴有胃肠道疾病;合并其他类型肝炎;参与本研究前30 d已接受其他相关治疗;病历资料缺乏;无法完成本次研究者。

1.3 方法

(1)所有参检者于入组后第1 d采集3 ml清晨空腹肘静脉血,将血液标本放置于抗凝试管中,充分混匀,应用流式细胞技术测定TLR4表达水平。将血液标本放置于两个各含100 L的抗凝血液标本,1支分别加入5 L FITC-CD14单抗及5 LPE-TLR4单抗,另1支试管中加入5 L PBS液,将其充分摇匀后置于4 ℃环境下放置30 min,随后于两支试管中加入2 ml红细胞裂解液,充分震荡摇匀后于室温环境下避光保存20 min,应用PBS液洗涤2次,以3500 r/min速度,离心10 min后弃上层血清,加入PBS液调整浓度,应用流式细胞仪测定阳性率。(2)肠道菌群分布:采集所有参检者新鲜粪便样本0.5 g,按照10倍系列稀释法对其行稀释操作,使用培养基培养相对应的肠道菌群。

1.4 观察指标

(1)分析各组外周血CD14+TLR4+表达阳性率;(2)对比各组肠道菌群分布情况;(3)分析单核细胞表面TLR4表达与肠道菌群分布间的关系;(4)分析TLR4表达与肝癌患者预后的关系。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组外周血CD14+TLR4+表达阳性率比较

肝硬化组CD14+TLR4+单核细胞阳性率为(49.25±8.86)%、肝炎组阳性率为(41.93±7.45)%、肝癌组阳性率为(57.68±9.85)%、对照组为(33.74±4.75)%。肝癌组外周血TLR4+单核细胞阳性率最高,与肝炎组、肝硬化组及对照组比较,有统计学差异(P<0.05)。

2.2 各组肠道菌群分布比较及相关性

肝癌组双歧杆菌、乳酸杆菌菌群分布均少于肝硬化组、肝炎组及对照组,肠球菌及大肠埃希菌菌群分布均多于肝硬化组、肝炎组及对照组,有统计学差异(P<0.05);经Pearson相关性分析显示,单核细胞表面TLR4表达与双歧杆菌、乳酸杆菌呈负相关(γ=-0.673、-0.644,P=0.022、0.015);单核细胞表面TLR4表达与大肠埃希菌及肠球菌呈正相关(γ=0.742、0.776,P=0.012、0.007),见表1。

表1 各组肠道菌群分布比较

2.3 TLR4表达与肝癌患者预后

对患者进行随访,30例肝癌患者中复发9例,死亡7例。复发及死亡患者外周血中单核细胞阳性率分别高于未复发及存活者,有统计学差异(P<0.05),见表2。

表2 TLR4表达与肝癌患者预后分析

2.4 肠道菌群分布与肝癌患者预后的关系

未复发及死亡患者双歧杆菌、乳酸杆菌菌群分布均高于复发者及存活者,肠球菌及大肠埃希菌菌群分布少于复发者及存活者,有统计学差异(P<0.05),见表3。

表3 肠道菌群分布与肝癌患者预后的关系

3 讨论

正常人体肠道内存在大量、稳定的肠道菌群,但可被培养的仅为400种,且各种肠道菌群代谢产物均经肝脏门静脉分解及排出,与肝脏共同担负免疫调节及代谢作用[8-9]。若肝脏出现病变,其代谢内毒素能力减弱,肠道菌群的多样性减少,而有害菌群及代谢产物量升高,加重肝功能损伤,形成恶性循环。粪便是肠道菌群代谢的主要产物,通过观察菌群变化可在一定程度上反映肠道菌群状态,有助于及时调整诊疗方案,以改善患者病情[10-11]。

TLR家族中共存在10个基因能够介导机体的免疫功能,其中TLR4包括胞内结构、跨膜结构、胞外结构三个结构域的跨膜蛋白,Toll受体结构域存在于胞内结构中,亮氨酸重复序列存在于胞外结构,能够特异性识别PAMP及损伤相关分子模式,各指标不断变化可促使肝脏相关炎症因子、趋化因子及其他相关介质水平升高,导致肝脏发生病理性改变[12-13]。本研究结果显示, 肝癌组外周血TLR4+单核细胞阳性率最高,与肝炎组、肝硬化组及对照组比较有统计学差异,肝癌组双歧杆菌、乳酸杆菌菌群分布均少于肝硬化组、肝炎组及对照组,肠球菌及大肠埃希菌菌群分布均多于肝硬化组、肝炎组及对照组,且单核细胞表面TLR4表达与双歧杆菌、乳酸杆菌呈负相关(γ=-0.673、-0.644,P=0.022、0.015),与大肠埃希菌及肠球菌呈正相关(γ=0.742、0.776,P=0.012、0.007);复发及死亡患者外周血TLR4+单核细胞阳性率较高,两组比较有统计学差异,未复发及死亡患者双歧杆菌、乳酸杆菌菌群分布均高于复发者及存活者,肠球菌及大肠埃希菌菌群分布少于复发者及存活者。其原因在于TLR4与肝癌预后存在密切联系,且肠道菌群变化在肝癌预后的评估中意义重大,TLR4表达水平越高,双歧杆菌及乳酸杆菌水平越低,肠球菌及大肠埃希菌水平越高,充分说明TLR与肠道菌群相辅相成,共同影响肝脏结构[14-15]。

综上所述,TLR4和肠道菌群与原发性肝癌发生及发展存在密切联系,可为预测患者预后提供参考,据此及时调整治疗方案,有助于促进病情转归。