食品中副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果分析

◎ 陆 雯，彭醒醒，朱晗昀，俞琦娅，王 珍

（绿城农科检测技术有限公司，浙江 杭州 310000）

能力验证是认可实验室技术能力的重要方式，它已经成为中国合格评定国家认可委员会保障实验室认可的手段[1]。参加能力验证可帮助实验室发现潜在问题，及时采取预防措施，提高实验室的技术能力和管理水平。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）和单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是重要的食源性致病菌。VP 为革兰氏阴性无芽孢杆菌，具有嗜盐性，主要存在于海产品中，是许多沿海国家发生食物中毒的重要病原菌之一，该病菌在中国位居食源性细菌感染疾患的前3 位[2]。李斯特菌属（Liareria）共分2 个群，7 个种，LM 简称单增李斯特菌，为革兰氏阳性短杆菌，是唯一能引起人畜共患病的病原菌，20 世纪90 年代被WHO 列为四大食源性致病菌之一，其余3 种为大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。LM 能引起肠胃炎、败血症、脑膜炎和流产等，对免疫力低下、孕妇等人群影响较大，广泛存在于自然界中[3-4]。目前，VP 和LM的检测技术主要有传统生物学培养、全自动鉴定系统、分子生物学检测技术等，如荧光定量PCR 检测法、MALDI 飞行时间质谱（MALDI-Time of Flight Mass Spectrometer，MALDI-TOF-MS）、微流控检测等[4-8]。本实验室采用传统生物学培养及普通生化鉴定的方法，结合荧光定量PCR 检测法和MALDI 飞行时间质谱检测进一步确认结果，分析过程中出现的可疑现象，提高结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

ACAS-PT1599 食品中副溶血性弧菌（定性）检测能力验证、ACAS-PT1366 乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌（定性）检测能力验证，各2 份样品，均由中国检验检疫科学研究院组织实施。

1.1.2 培养基及试剂

3%TSA、3%氯化钠碱性蛋白胨水、TCBS、弧菌显色培养基、LM 生化鉴定试剂盒、李氏菌增菌肉汤（LB1，LB2）基础与配套添加剂、LM 显色培养基、PALCAM 琼脂、TSA-YE 琼脂，购自海博生物技术有限公司；副溶血性弧菌细菌生化鉴定盒，购自环凯微生物科技有限公司；羊血琼脂平板，购自北京陆桥生物技术有限公司；Premix Ex TaqTM（RR390Q）试剂盒，购自宝生物工程有限公司。

1.1.3 引物探针

采用《出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》（SN/T 1870 2016）[12]提供的引物探针序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 对照菌株

副溶血性弧菌ATCC17802、单核细胞增生李斯特氏菌CICC23929、英诺克李斯特氏菌ATCC33090、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌ATCC35967，均为本实验室保存的工作菌株。

1.2 仪器与设备

LRH-250F 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；HFSafe-1500LC 生物安全柜，力康生物医疗科技控股有限公司；BagnMixer400CC 拍击氏均质器，法国英特塞恩斯有限公司；BSA224S 电子天平，德国赛多利斯公司；精密移液器，德国艾本德股份公司；CFX96荧光定量PCR 仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；rapifleX MALDI-TOF-MS，美国布鲁克道尔顿公司。

1.3 实验方法

1.3.1 副溶血性弧菌样品检验方法

（1）传统生物学培养检验。按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》（GB 4789.7 2013）[9]检测2 个样品。

（2）荧光定量PCR 扩增。取经GB 4789.7 2013[9]中的方法增菌的培养物1 mL，置于1.5 mL 离心管中，8 000 r·min-1离心1 min，弃去液体，沉淀物用无菌水反复清洗离心2 次，用100 µL 无菌水制成菌悬液，100 ℃处理5 min，此液体作为模板，根据SN/T 1870 2016[12]，开展副溶血性弧菌荧光定量PCR 扩增实验。

（3）飞行质谱鉴定。用1 µL 接种环挑取经过3%TSA纯化的可疑菌落，均匀涂布于靶板上，滴加1 µL MS-CHCA 基质液，待其干燥，放入飞行质谱仪器进行检测，自动图谱分析，给出确信分值，得出鉴定结果。

1.3.2 单增李斯特菌样品检验方法

（1）传统生物学培养检验。按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30 2016）[10]第一法进行检测。

（2）荧光定量PCR 扩增。分别取经GB 4789.30 2016）[10]方法中LB1、LB2增菌的培养液进行单增李斯特菌荧光定量PCR 扩增实验，具体步骤同1.3.1（2）。

（3）飞行质谱鉴定。取经过TSA-YE 琼脂培养基纯化的可疑菌落，进行飞行质谱鉴定，步骤同1.3.1（3）。

2 结果与分析

2.1 副溶血性弧菌样品检验结果

2.1.1 传统生物学培养检验结果

副溶血性弧菌样品检验结果见表1、表2。2 个样品经3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌液培养后变浑浊，说明样品中存在活的微生物。培养物分别划线接种平板进行分离，培养后显色平板上分离出典型菌落，TCBS平板上分离出绿色具有口香糖质感的可疑菌落，分别转接3%TSA 平板纯化培养，菌落形态、氧化酶试验、革兰氏染色镜检、3%氯化钠三糖铁琼脂穿刺反应、嗜盐试验及生化鉴定结果均与副溶血性弧菌相符，即样品中检出副溶血性弧菌。

表1 副溶血性弧菌初步鉴定结果表

表2 副溶血性弧菌生化鉴定结果表

2.1.2 荧光定量PCR 扩增结果

利用副溶血性弧菌引物探针对副溶血性弧菌样品增菌液进行荧光定量PCR 扩增反应，出现了与副溶血性弧菌阳性对照一致的典型“S”型曲线，见图1。在检测开始24 h 内，确认样品副溶血性弧菌阳性。

图1 副溶血性弧菌样品扩增结果图

2.1.3 飞行质谱鉴定结果

副溶血性弧菌样品经1.3.1（3）步骤上机分析，结果显示为副溶血性弧菌，2 个样品得分为1.894、2.076，得分为1.7 ～3.0 表示阳性结果，检测48 h 内进一步确认样品检测结果为副溶血性弧菌阳性。

2.2 单增李斯特菌样品检验结果

2.2.1 传统生物学培养检验结果

单增李斯特菌样品检验结果见表3、表4。2 个样品经LB1、LB2增菌液培养后变浑浊，说明样品中存在活的微生物。

表3 单增李斯特菌初步鉴定结果表

表4 单增李斯特菌生化鉴定结果表

培养物划线接种平板进行分离，培养后显色平板上分离出典型菌落，PALCAM 平板上分离出灰绿色中间有黑色凹陷的菌落，分别转接TSA-YE 琼脂平板纯化培养，菌落形态、酶促试验、革兰氏染色镜检、溶血试验及生化鉴定结果均与单增李斯特菌相符，但其中一个样品的溶血试验可疑，溶血圈大小界于伊氏李斯特氏菌和单增李斯特菌之间，如图2 所示。结合荧光定量PCR 和飞行质谱鉴定结果，排除可疑，确认样品中检出单增李斯特氏菌。

图2 单增李斯特菌样品2 溶血试验结果图

2.2.2 荧光定量PCR 扩增结果

利用单增李斯特菌引物探针对单增李斯特菌样品进行荧光定量PCR 扩增反应，出现了与单增李斯特菌阳性对照一致的典型“S”型曲线，见图3。在检测24 ～48 h 内确认样品检测结果为单增李斯特氏菌阳性。

2.2.3 飞行质谱鉴定结果

单增李斯特菌样品经过上机分析，结果显示为单增李斯特菌，得分在1.7 以上，得分1.7 ～3.0 表示阳性结果，在检测开始48 h 内进一步确认样品检测结果为单增李斯特菌阳性。

3 结论与讨论

ACAS-PT1599 的2 个样品均检出副溶血性弧菌，ACAS-PT1366 的2 个样品均检出单增李斯特菌，上报结果后获得满意结果。本次能力验证采用了常规国家标准方法，借助荧光定量PCR 法和飞行质谱进行辅助确认，使结果更加可靠。此外，检测人员掌握了不同方法，提高了检测人员和实验室的检测水平。

副溶血性弧菌和单增李斯特菌常规国家标准方法检测周期一般需要4 ～7 d，副溶血性弧菌常规国家标准方法中的嗜盐试验需通过肉眼判断菌体的生长情况，易出现偏差，单增李斯特菌常规国家标准方法中溶血试验表现出狭窄清晰的溶血圈，但本次单增李斯特菌能力验证中样品2 分离的可疑菌落表现出的溶血圈大小介于伊氏李斯特氏菌和单增李斯特氏菌之间，在结果判定上存在干扰。利用荧光定量PCR 仪或飞行质谱不仅可在48 h 内确认结果，还能排除传统方法鉴定确认过程中的可疑菌落，使结果更可靠。