蜡样芽胞杆菌根状生长实验方法探讨

◎ 廖丽辉，侯艳飞，秦 捷，向忠平

（湖南省怀化市疾病预防控制中心，湖南 怀化 418000）

蜡样芽胞杆菌在自然界中广泛存在，很容易引起食物污染，食物受该菌产毒菌株污染后，从外观、气味上无显著变化，食入后会引起食物中毒[1]。中毒后，还可引起败血症、心内膜炎、创伤和肺部感染等疾病[2]。蜡样芽胞杆菌与蕈状芽胞杆菌在实验室检测中生化实验很相近，难以区分，而根状生长是区分二者的重要实验，而国标中的“山谷状生长”和“根状生长”受很多因素影响，易导致主观误判，造成假阳性。因此，精准快速的检测出蜡样芽胞杆菌尤为重要。为了解不同条件下蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌根状生长检测效果，本文选择蜡样芽胞杆菌标准菌株、蕈状芽胞杆菌标准菌株、实验室分离株，用普通营养琼脂培养基（Nutrient Agar，NA）、平板计数琼脂培养基（Plate Count Agar，PCA）、胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptose Soya Agar，TSA）、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂培养基（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE），在单因素变量情况下，筛选根状生长实验最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

NA 培养基、PCA 培养基、TSA 培养基、TSA-YE培养基、脑心浸出液肉汤、血琼脂平板均由青岛海博技术有限公司生产；蜡样芽胞杆菌标准菌株（CMCC 63306）、蕈状芽胞杆菌标准菌株（ATCC 10206）、实验室检出的蜡样芽胞杆菌30株，蕈状芽孢杆菌20株。

NU-425-400 生物安全柜（Nuaire 公司）、GHP-9160 隔水式恒温培养箱（上海一恒）、TP-3000E 电子天平（湘仪天平）、SQ510C 高压灭菌器（雅马拓科学）、HRCJ-2D 超净工作台（青岛海尔）。

1.2 实验前准备

将蜡样芽胞杆菌标准储备菌株（简称LY 标株）、蕈状芽胞杆菌标准储备菌株（简称XZ 标株）、实验室蜡样芽胞杆菌（简称LY）、实验室蕈状芽胞杆菌（简称XZ）用脑心浸出液肉汤复苏，37 ℃培养过夜，后转至血平板上，待培养过夜后做根状生长实验。

1.3 实验方法

将经过高压灭菌的NA、PCA、TSA、TSA-YE培养基用移液管分别吸取9 mL、12 mL、15 mL、18 mL、20 mL 加入无菌平板中，打开盖子让其自然凝固，以减少琼脂表面的水分。不同的量体现平板培养基的厚度有所不同。将所有平板置于37 ℃温箱烘干5 h 后，使其在室温条件下过夜干燥。本次实验中蕈状标株（XZ 标株）为阳性对照株，分别用一次性无菌接种针将复苏好的菌株在上述不同量不同种类的培养基上做根状生长实验，然后分别放置在30 ℃和37 ℃恒温隔水式培养箱中培养，分别在24 h、48 h、72 h 时观察培养状态。

1.4 判断标准

依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》（GB 4789.14 2014）[3]对根状生长实验进行判别：山谷状生长判为阴性，根状生长判为阳性。

2 结果与分析

2.1 血平板培养结果

蜡样芽胞标准菌株在血平板上出现较宽的溶血环，表现为完全透明的β 溶血现象，蕈状芽胞杆菌标准菌株在血平板上溶血现象较蜡样标准菌株略弱，而实验室蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌大部分出现完全透明溶血环，仅个别菌株表现为草绿色溶血现象。

2.2 20 h、24 h 观察结果

经20 h 观察，仅37 ℃和30 ℃PCA 上的XZ 标株与其中的3 株XZ 划线边缘略有毛刺，表现有轻微根状现象，但其他平板上菌株划线边缘未见毛刺，仅沿接种线生长，结果无法判别。经24 h 观察所有平板，30 ℃培养条件下，9 mL 的NA 和TSA 琼脂平板上小部分XZ 划线边缘有微细且短的毛刺生长，但不足以判别阴阳性。而9 mL 和12 mL PCA 琼脂平板上，经24 h 培养的XZ 标株可见微小毛刺，其他XZ 不够明显，LY 标株基本上沿划线生长，未表现山谷状生长，9 mL PCA上30℃ 培养24 h的菌株生长形态如图1所示。

图1 30 ℃ 24 h 9 mLPCA 上菌落生长形态图

2.3 48 h 观察结果

经48 h 观察，30 ℃培养条件下，9 mL 的PCA、NA、TSA、TSA-YE 上大部分蕈状可见粗短不整齐的边缘，大部分蜡样在上述平板上沿接种线生长，边缘有类似不规整的波浪状，扩张于接种线外，故此时判定根状生长阴阳性结果不够准确，但不同种类平板中，PCA 和NA 效果更佳。37 ℃培养条件下，因菌落生长快，整体偏大，导致蕈状毛刺不明显，且蜡样芽胞杆菌山谷状的形态不能显现出来，容易误判。30 ℃ PCA和NA 平板上的生长特征如图2 所示。

图2 30 ℃ 48 h 9 mL PCA 和NA 上菌落生长形态图

2.4 72 h 观察结果

经72 h 观察，30 ℃条件下9 mL 的PCA、NA、TSA、TSA-YE均可判定根状生长阴阳性结果：LY及LY标株呈山谷状生长，结果判阴性，XZ 和XZ 标株呈根状生长，结果判阳性。选取LY 标株、XZ 标株及其中一株食品LY 株，生长状态见图3、图4、图5、图6。因其他平板均带XZ 标株、LY 标株做对照，故不一一呈现。

图3 30 ℃ 72 h PCA 上菌落生长形态图

图4 30 ℃ 72 h NA 上菌落生长形态图

图5 30 ℃ 72 h TSA-YE 上菌落生长形态图

图6 30 ℃ 72 h TSA 上菌落生长形态图

经观察，琼脂厚度越薄，同一种培养基根状生长实验越容易区分。9 mL 和12 mL 的4 种不同种类的平板结果表明，在PCA 平板、NA 平板、TSA 平板上30 株LY 均可明显看到菌苔沿接种线扩张生长，且呈波浪纹，无细小毛刺，即呈现明显山谷状生长现象，结果为阴性，20 株XZ 均可见丰富的毛须，且较LY的波浪状更细更密集，树根样扩展开，呈现根状生长，结果为阳性，生长现象见图3、图4、图5（右上角平板）。同时，LY标株和XZ标株均可判定结果。而TSA-YE上，30 株LY 均呈现山谷状生长，18 株XZ 判为根状生长，还有2 株XZ 根状现象无法判别。

当琼脂量在15 mL 时，PCA 琼脂上29 株LY 和18 株XZ 仍可判断结果，NA 琼脂上28 株LY 和19 株XZ 可判断结果，TSA 琼脂上27 株LY 和14 株XZ 可判断结果，TSA-YE 琼脂上24 株LY 和5 株蕈状可判断结果。

当琼脂量在18 mL 和20 mL 时，所有平板上菌苔均沿线扩大，整体较粗，易影响结果判断，PCA 琼脂上15 株LY 和6 株XZ 结果比较明显，NA 琼脂上13 株LY 和5 株XZ 结果也可判别。在TSA 和TSA-YE上，18 mL 虽较20 mL 菌苔窄，但总体偏粗，均出现大锯齿状，导致XZ 和LY 边缘生长特征均不明显，无法判别。

37 ℃培养条件下，菌株在划线上因生长过快而较粗大，会影响结果判断，整体看来，LY 结果受影响较少，故不容易出现假阴性，但XZ 结果受琼脂厚度影响较大，易造成假阳性结果，且琼脂量越多，即厚度越厚，假阳性率越高。从不同种类的琼脂来看，PCA效果最佳。

3 结论与讨论

蜡样芽胞杆菌的繁殖体较为耐热，加热100 ℃20 min 可以被杀死，它产生的芽孢可在环境中长期存在并大量繁殖[4]，引起的中毒事件屡见不鲜，准确快速地区分蜡样和蕈状的实验工作极其重要，从上述实验结果可发现，根状生长实验可以受培养基种类、培养基厚度、培养温度、培养时间等因素影响，尤其对于从事蜡样芽胞杆菌检测的新人员来说有一定难度，实验结果受主观影响，容易将蕈状判为蜡样，从而直接影响肠毒素等后续检测工作，导致结果出错。尤其在由蜡样引起的食物中毒发生时，快速提高检测能力，准确查出致病因子是重中之重。受多因素影响，实际工作中蕈状和蜡样在MYP 平板上形态很相近，不具有典型菌落形态，且因蜡样的动力实验有些型别为阴性，故动力实验并不能很好地区分蕈状和蜡样。根状生长实验在区分二者上意义重大，本次实验标准菌株和实验室随机选取的实验株更具有代表性，为实验室提供一定的理论基础。

近年来，蜡样芽胞杆菌食物中毒比例较高，常见此菌检出自米面、谷物、肉制品等富含碳水化合物的食品[5]。实验室可以选择合适的平板，以提高工作效率。本次实验优化了培养条件，由图1 可见，经24 h 培养后，在PCA 平板上，LY 的山谷状生长及XZ的根状生长并不明显，极个别可粗略判断结果，在其他3 种培养基上，XZ 毛刺未长出，且LY 沿线生长，无山谷状现象，可能与培养时间不够，菌数达不到扩展生长量有关；经48 h 后，PCA 平板优势显现出来，尤其是XZ 毛须初形成，但与LY 的波状纹相似，主观判断不肯定；经72 h 后，菌落形态见图3、图4、图5、图6，经观察，XZ 的根状现象和LY 的山谷状能明显区分，尤其XZ 根状多而细长，在平板厚度相同条件下，不同培养基PCA ＞NA ＞TSA ＞TSA-YE；由72 h培养的图片显示，同一平板不同量区别很大，但9 mL和12 mL 在PCA 和NA 上因仅3 mL 体积差，对厚度的改变不大，效果尚可，其中以9 mL 最明显，平板厚度9 mL ＞12 mL ＞15 mL ＞18 mL ＞20 mL。因此，实验室在用根状生长区分蜡样和蕈状时，可倾注9 mL的PCA 经干燥表面水分后在30 ℃培养72 h，非常容易区分根状生长和山谷状生长，且XZ 判为LY 的假阳性率极低（20 株/20 株，0%），注意培养时间不能超过72 h，否则平板易干燥开裂，不利于结果观察。当基层实验室未储备PCA 时，可按照GB 4789.14 2014使用NA 平板，但培养时间可延长至72 h（国标为24 ～48 h），且琼脂的量控制在9 mL。当储备PCA 时，该实验可首选PCA，从而提高检出率，降低假阳性率，为蜡样芽孢杆菌引起的食源性突发事件处置提供一定的参考。