响应面法结合模糊评价优化油橄榄果渣饮料发酵工艺

◎ 王 锴，石庆东，张成毅，王福伟，杨琴琴，虞欢欢，古小露

（1.重庆第二师范学院生物与化学工程学院，重庆 400067；2.重庆第二师范学院 脂质资源利用及儿童日化品研发重点实验室，重庆 400067；3.重庆食品工业研究所有限公司，重庆 400010）

橄榄果渣是指橄榄果榨取橄榄油之后所剩余的固体废料以及橄榄皮等部分，果渣中含有橄榄多酚、脂肪酸、纤维素等有益成分。在传统工艺中，它们多被用于生产橄榄渣油。橄榄果渣油被广泛用于制药、化妆品、食品等领域。此外，橄榄果渣被用于制作饲料、肥料和木材等。近年来，越来越多的研究表明，橄榄果渣油还具有抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂等多种保健功效[1]。因此，橄榄果渣的进一步开发和利用已经成为一个备受关注的研究领域。

在橄榄果渣的食品应用方向，苏瑶等[2]通过在米酒酿制过程中添加橄榄果渣制作了一种风味独特的橄榄果渣酒；古小露等[3]在传统酥性饼干基础上添加油橄榄果渣和果渣粉，丰富饼干营养成分，研发出一款口感层次丰富、酚类成分含量较高的酥性饼干。两者都在一定程度上利用了橄榄果渣中含量丰富的多酚类物质，减少了橄榄果渣的浪费。但酒品有一定的局限性，受众较小；饼干加工过程会导致一部分酚类物质丢失，因此本文对橄榄果渣酒饮料发酵工艺进行研究，以期研发出一种橄榄果渣酒饮料，促进橄榄果渣的进一步开发和利用。

发酵是指微生物在有氧或者无氧条件下的代谢过程。在橄榄果渣酒饮料的生产过程中，发酵可以产生酒精以及其他香气物质，因而发酵对于产品风味和感官特性的影响极其深远。本实验主要探究发酵工艺对于橄榄果渣酒饮料的影响。通过查阅文献发现，影响发酵的主要因素有发酵温度、发酵时间、酵母添加量和初始糖度值[4-6]。本实验先进行发酵工艺的单因素试验，研究发酵温度、发酵时间、酵母添加量、初始糖度值等因素的最佳范围[7]。再以感官评分为响应值，在单因素试验的基础上进行响应面试验，确定发酵温度、发酵时间、酵母添加量、初始糖度值这些因素的最佳水平，获得橄榄果渣酒饮料最佳的发酵工艺。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

油橄榄果渣，重庆江源油橄榄开发有限公司；白砂糖，超市购买；三氯蔗糖，安徽金禾实业有限公司；单宁酶，凯源生物科技有限公司；安琪果酒酵母，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖，西王药业有限公司。

1.2 仪器与设备

C21RK2106 电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司；YH-M3000g 电子天平，五鑫衡器有限公司；WZB 85 恒温培养箱，深圳市三莉科技有限公司；DHP-9032 折光仪上海仪，电光学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 油橄榄果渣饮料的基本配方

根据前期研究，油橄榄果渣发酵饮料主要成分配方为油橄榄果渣含量44%、白砂糖含量20%、单宁酶含量1%、三氯蔗糖酶含量0.04%、葡萄糖含量0.3%、饮用水34.66%。

2.2 油橄榄果渣饮料的生产工艺流程及操作要点

油橄榄果渣饮料的生产工艺流程如图1 所示。

图1 油橄榄果渣饮料的生产工艺流程图

（1）预处理。油橄榄果渣经挑选、脱核机脱核和打浆后，进行巴氏消毒（70 ～80 ℃，10 min）；将消毒完毕的油橄榄新鲜果渣放进冷冻干燥机中干燥后备用；将要使用的器具在高压灭菌锅中灭菌备用。

（2）脱涩。将干燥好的油橄榄果渣装入烧杯中，按照1 ∶2 的比例加入饮用水。烧杯中加入混合液质量0.10%的单宁酶和0.015%的三氯蔗糖，在水浴50 ℃条件下保持15 min，进行脱涩处理。

（3）调整成分与酵母菌活化。向脱涩后的油橄榄混合液中加入白砂糖，用手持式糖度计测量糖度，直至糖度达到固定值。按照1 ∶1 的比例加入安琪果酒酵母和葡萄糖，加入适量的35 ℃的温开水，搅匀，放置于35 ℃水浴中进行活化，直至固体中有气泡冒出。

（4）油橄榄果渣发酵。将制备的混合液、活化的酵母混合后，转入洁净且灭过菌的密封瓶中，混匀，盖好密封瓶。在适当的温度下进行发酵，在发酵至7 d左右时溶液出现较多大气泡，终止发酵。

（5）调配。用纱布先将油橄榄果渣过滤，得到澄清液体，再加入适量糖液，装瓶。

2.3 油橄榄果渣饮料发酵工艺优化

2.3.1 单因素试验

（1）发酵时间。根据2.1 的配方制备原料5 份，分别加入1.5 g 酿酒酵母，在25 ℃、初始糖度为30%的条件下进行发酵。分别在3 d、4 d、5 d、6 d、7 d取样进行糖度测试，并进行感官评分，从而确定最佳发酵时间的范围。

（2）发酵温度。根据2.1 的配方制备原料5 份，分别加入1.5 g 酿酒酵母，设置初始糖度为30%，在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃下均发酵5 d。分别对不同温度下的产品取样进行糖度测试，并进行感官评分，确定饮料的发酵温度范围。

（3）酵母添加量。根据2.1 的配方制备原料5 份，分别加入0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g 酿酒酵母，设置发酵温度为25 ℃，初始糖度为30%，发酵5 d。分别对不同酵母添加量的产品取样进行糖度测试，并进行感官评分，确定酵母添加量范围。

（4）初始糖度。根据2.1 的配方制备原料5 份，分别加入1.5 g 酿酒酵母，设置发酵温度为25 ℃，分别设置初始糖度为25%、30%、35%、40%和45%，发酵5 d。分别对不同初始糖度下的产品取样进行感官评分，确定初始糖度范围。

2.3.2 响应面试验方案设计

表1 响应面试验因素水平表

2.4 指标测定

2.4.1 糖度测定

油橄榄果渣饮料中糖度的测量由手持糖度计确定。

2.4.2 产品的模糊感官评定

感官评定是食品开发中一种非常实用的方法，能对消费者的实际感觉从多方面进行直观评价。但由于进行评定的主体是人，评定结果非常容易受到感官品检员的个人喜好和评定组成员组成的影响，所以本次实验引入模糊感官评定的方法对产品进行评定。模糊感官评定在常见的食品感官评定中引入了模糊数学评判，通过模糊矩阵将评价结果量化，排除主观性。本文选取10 位有感官评判经验的食品专业人员，在感官评定室进行感官评定。

（1）因素集的确定。由于《食品安全国家标准 发酵酒及其配制酒》（GB 2758 2012）对于产品的感官评定要求为“应符合相应产品标准的有关规定”，但目前没有橄榄果渣发酵酒饮料的国家标准或者行业标准，所以本文参照行业标准《橄榄制品》（NY/T 710 2003） 、国家标准《固体饮料》（GB/T 29602 2013），对产品的色泽、香气、口味、风格进行评价，并据此设计表2。

表2 油橄榄果渣饮料模糊感官评定标准表

因素集指的是影响被评判样品质量的指标集，表示为U=(u1,u2, ,ui, ,um)，其中U为因素集，ui为第i个因素。对于油橄榄果渣酒饮料的感官评定，可以确定其中4 项指标组成的因素集，U=(色泽u1，香气u2，口味u3，风格u4)。

宝玑先生一生共创作35枚陀飞轮时计，其中已知存留于世的不到10枚。西班牙波旁王朝唐·安东尼奥（Don Antonio）亲王于1808年购入的No. 1188陀飞轮精准计时怀表是品牌史上顶级时计杰作之一。这款怀表将自2018年6月26日起进驻设立于宝玑苏黎世精品店的宝玑博物馆进行展出。此外，宝玑还珍藏着另外两枚极具历史意义的陀飞轮怀表，分别为宝玑先生于1809年售出的No.1176以及于1812年售出的No.2567，其原始记录一并贮存，记载下了每一步历史创作的过程。

（2）评语集的确定。评语集指的是被评样品所属质量级别的集合，以V=(v1,v2, ,vi, ,vm)表示。其中，V是评语集，vi指的是第i级评定语。通过探讨，选择橄榄果渣酒饮料的评语集为V=(优v1,良v2,中v3，差v4)，各级评定语对应的感官评定标准见表2。

（3）权重集的确定。10 名感官评价员分别对橄榄果渣酒饮料的4 个因素（色泽、香气、口味、风格）的重要性进行打分，总分为100 分，得分越高代表质量因素越重要，所占权重越大，结果如表3 所示。最终确定了橄榄果渣酒饮料的色泽、香气、口味、风格权重分别为0.1、0.2、0.3、0.4。所以，橄榄果渣酒饮料的权重集X=(0.1,0.2,0.3,0.4)。

表3 权重集的确定表

（4）建立模糊矩阵。根据对各组样品进行的感官评判可以得到不同因素的评价结果，可以得到如Uj的模糊矩阵。其中，j=1,2,3,4,5,6,7,8,9，为样品编号，每一行代表一个评价因素的评价结果。对每种橄榄果渣酒饮料样品可得到矩阵，并进行归一化。依据模糊变换原理：Y=X·U，则对第j号样品的综合评价结果为Yj=X·Uj。

（5）模糊评价综合得分。分别赋予优秀、良好、中等和较差4 个等级得分为90 分、80 分、70 分和60 分。将2.4.6 中得到的Yj中的各个量乘以对应的分数再相加，便可以得到对应样品的感官得分。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 发酵时间对油橄榄果渣饮料的影响

如图2所示，随着发酵时间的延长，糖度逐渐减小，3 ～6 d 下降明显，但第6 天开始糖度下降趋势平缓。随着发酵时间的延长，酒精等代谢产物累计含量升高，导致酵母的生物活性受到抑制而降低，所以糖度降低开始放缓，在降低到一定程度后趋于平稳。随着发酵时间的增加，感官评分先增大后减小，在5 d 时发酵的油橄榄果渣饮料口感舒适，透明度良好，符合油橄榄果渣饮料的基本要求，感官评分最高。

图2 发酵时间对油橄榄果渣饮料糖度和感官评分的影响图

3.1.2 发酵温度对油橄榄果渣饮料的影响

由图3 可知，在初始糖度为30%的情况下，温度对发酵起着重要的作用。从糖的消耗量上来看，15 ～20 ℃时，糖的消耗量随着发酵温度的升高出现降低的趋势，在25 ℃时糖度最低，糖的消耗量最大。可能因为此时酵母的活性最强，进行大量的生理活动，所以糖的消耗量最大。随着发酵温度的升高，感官评分也呈现先上升后下降的趋势，25 ℃时油橄榄果渣饮料所得感官评分最高，风味最佳，无异味，具有特有的油橄榄风味。由此可确定酵母的最佳发酵温度范围为20 ～30 ℃。

图3 发酵温度对油橄榄果渣饮料糖度和感官评分的影响图

3.1.3 酵母添加量对糖度和感官品质的影响

由图4 可知，随着酵母添加量的增加，发酵强度增大，糖度逐渐减小，可知酵母添加量对糖度影响较大，酵母添加量越多，代谢所需能量越多，消耗糖分越多。对于感官分析可知，酵母添加量为1.0 g 时，口感舒适，味道最佳，减少或者增加酵母含量都会导致口感降低。

图4 酵母添加量对油橄榄果渣饮料糖度和感官评分的影响图

3.1.4 初始糖度对油橄榄果渣饮料感官评分的影响

初始糖度为35%时，油橄榄果渣饮料口感协调柔和，初始糖度＞35%时，糖度过高，会影响酵母的发酵作用，致使油橄榄果渣饮料感官品质下降。由图5可知，初始糖度为35%时口味最佳。由此可知，初始糖度的最佳范围在30%～40%。

图5 初始糖度对油橄榄果渣饮料感官评分的影响图

3.2 模糊评价

根据响应面试验方案设计的要求，对实验组的产品的色泽、香气、口味、风格4 个方面进行评价。以第1 组的感官评价结果为例，评定结果见表4。

表4 组合1 的评定结果表

由表4 可知，10 个人对组合1 的色泽评价结果：4 人认为优、4 人认为良、2 人认为中、0 人认为差。对香气的评价结果：3 人认为优、5 人认为良、2 人认为中、0 人认为差。对口味的评价结果：4 人认为优、3 人认为良、3 人认为中、0 人认为差。对风格的评价结果：3 人认为优、4 人认为良、3 人认为中、0 人认为差。因此可得V色泽=(0.4,0.4,0.2,0)，V香气=(0.3,0.5,0.2,0)，V口味=(0.4,0.3,0.3,0)，V风格=(0.3,0.4,0.3,0)，将以上4 个因素转化为矩阵可得

根据模糊变换原理：Y=U·R，对组合j号样品的综合评价结果为Yj=X·Uj，因此1 号产品的综合评价结果为

感官评分计算：Z1=0.36 90+0.39 80+0.25 70+0 60=81.1。

同理可得其余实验组合的感官得分，见表5。

表5 油橄榄果渣饮料配方优化响应面法实验设计与结果表

3.3 发酵工艺响应面试验结果分析

在单因素实验结果分析的基础上，采用了Box-Behnken 实验设计，得到回归方程为

由表6 的回归分析可知，回归模型P＜0.01，极显著，而失拟项P＞0.05，不显著，说明该二次回归模型显著，油橄榄果渣饮料配方优化试验的结果可以用该模型预测。由该方程的一次项系数可知，4 个因素对感官评分影响的顺序是C＞A＞D＞B。

表6 响应面法对配方优化的ANVOA 分析表

图6结果显示，发酵时间、发酵温度、酵母添加量、初始糖度之间的交互作用对橄榄渣饮料的感官评分都有一定的影响。在这4 个因素中，酵母添加量与初始糖度之间的相互作用对复合饮料的感官评分影响最大，先上升后下降。这主要是由于低剂量时，饮料的口感、色泽和风格都随着代谢产物的增加而提升，但超过最佳剂量时也会由于代谢产物的累积而变差。

图6 油橄榄果渣饮料感官评分的响应面和等高线图

经过软件计算分析得出油橄榄果渣饮料的最佳配方和工艺为发酵时间5.198 7 d，发酵温度25.17 ℃，酵母添加量1.259 g，初始糖度36.088%。在此配方下，制得的饮料感官评分为85.066 分。结合实际情况，对数值进行修约，并在发酵时间5 d、发酵温度25 ℃、酵母添加量1.3 g、初始糖度36%发酵条件下进行3 次验证性实验，得该饮料的平均感官评分为86.82 分。

4 结论

本文采用模糊感官评价法替代传统的感官评价方法，提高了测试结果的准确性，使其结果更加客观可靠。采用响应面法结合模糊感官评价结果对橄榄渣饮料的配方进行优化，得到最佳配方为发酵时间 5 d、发酵温度25 ℃、酵母添加量1.3 g、初始糖度36%，此配方下制得的油橄榄果渣饮料感官评分为86.82 分，其具有油橄榄果渣独有的淡黄色，外观透明发亮，酒香偏淡，口感丰富味道协调，风格良好。