基于网络药理学探讨小承气汤治疗术后肠梗阻作用机制

戚 运,陈苏宁

0 引言

术后肠梗阻(Postoperative ileus,POI)是腹部手术后的常见并发症[1]。常以腹胀、进食后呕吐、无排气排便为主要临床表现,约占腹部手术患者的10%～30%[2]。其发生与术中麻醉用药、神经反射抑制、炎症反应、应激等多种因素有关[3]。术后肠梗阻不仅会延长患者的住院时间,增加围手术期费用,而且影响患者手术后恢复,增加再次手术和术后感染的风险[3]。小承气汤(Xiaochengqi Decoction)源自《伤寒论》,由大黄、枳实、厚朴三味药组成,具有轻下热结、除满消痞之功效[4]。小承气汤作为一种常用的中药方剂,在国内各医疗机构得到广泛应用,既有成方或颗粒剂可供选择,也可根据患者具体情况调配。小承气汤对术后肠梗阻有显著的治疗效果,但其作用机制尚不明确。网络药理学是一种新兴的药物分析方法,其基于系统生物学、多向药理学和网络分析,能够构建“有效成分-靶点-基因-疾病”网络,从整体角度揭示药物与疾病的相互作用[5],这种方法对于复杂成分药物,特别是中药复方的作用机制分析具有明显优势。本文运用网络药理学方法,从有效成分、靶点、信号通路等方面,分析了小承气汤治疗术后肠梗阻的可能机制,并为后续的实验和临床研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 小承气汤有效成分及靶点的筛选 从中药系统药理学数据库(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)中检索小承气汤中大黄、枳实、厚朴三味中药的全部化学成分,并根据药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄性质(Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion,ADME),筛选出口服生物利用度(Oral bioavailability,OB) ≥30%和类药性(Drug-likeness,DL)≥0.18 的化学成分及其相应靶点[6]。

1.2 术后肠梗阻相关靶点的筛选 以“Postoperative ileus”为关键词,分别在Genecards(https：//www.genecards.org/)、Disgent(https：//www.disgenet.org/)、OMMI(https：//www.omim.org/)和TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)[7]4个数据库中检索术后肠梗阻的相关靶点,并综合各个数据库的结果,得出术后肠梗阻的可能作用靶点。

1.3 小承气汤与术后肠梗阻靶点的标准化及映射 将筛选出的小承气汤和术后肠梗阻相关靶点,分别在Unipro(https：//www.uniprot.org/)中进行标准化,选择“Human”作为种属条件,得到统一的基因名称。然后将这些基因名称在Venny2.1平台(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中进行映射,找出小承气汤和术后肠梗阻共有的靶点,并用韦恩图表示。

1.4 蛋白质相互作用(Protein-protein interactions,PPI)网络的构建 将小承气汤和术后肠梗阻的共有靶点基因输入String数据库(https：//cn.string-db.org/),应用多重蛋白分析功能,选择“Homo sapiens”作为物种,设定相互作用阈值为“medium confidence(0.400)”,构建了蛋白质相互作用网络图。在该图中,节点表示由单个蛋白编码基因产生的所有蛋白质,边表示蛋白质之间的相互作用证据。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 将小承气汤和术后肠梗阻的共有靶点基因输入David数据库(https：//david.ncifcrf.gov/),并设置Identifier为“OFFICE_GENE_SYMBOL”,species为“Homo sapiens”,List Type为“Gene List”。然后,选择Gene_Ontology中的“GOTERM_BP_DIRECT”“GOTERM_CC_DIRECT”“GOTERM_MF_DIRECT ”和Pathways中的“KEGG_PATHWAY”,进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并对结果进行数据可视化。

1.6 有效成分-靶点-通路网络图 将小承气汤的有效成分、靶点和通路的预测结果进行整合,并用Cytoscape 3.9.0 软件绘制了“有效成分-靶点-信号通路”的网络图。

2 结果

2.1 小承气汤有效成分及靶点的筛选 本文从 TCMSP 数据库中检索了小承气汤的全部化学成分,共计269种,其中大黄92种,枳实65种,厚朴139种。然后根据 ADME标准,以 OB≥30% 和 DL≥0.18 为筛选条件,剔除了没有靶点的化学成分,最终得到了31种有效化合物和147个相关靶点。这些化合物包括大黄10种,枳实19种,厚朴2种。按照 OB 值的大小排序,31种化合物的来源、OB 值和 DL 值如表1所示。

表1 小承气汤部分有效成分基本信息

2.2 术后肠梗阻相关靶点的筛选及药物与疾病靶点的映射 在Genecards、Disgent、OMMI和TTD 4个数据库中,以“postoperative ileus”为关键词,检索术后肠梗阻的相关靶点,并去除重复项,共得到286个靶点。然后,将这些靶点在Uniprot数据库中进行标准化,得到统一的基因名称。将这些基因名称在Venny2.1平台中进行映射,找出小承气汤和术后肠梗阻共有的靶点,共计36个,并用韦恩图表示,如图1所示。

图1 小承气汤治疗术后肠梗阻靶点韦恩图

2.3 PPI网络的构建 将小承气汤和术后肠梗阻的36个共有靶点输入String数据库,构建了蛋白质相互作用网络图,并在图2中展示。在该图中,节点表示蛋白质,边表示蛋白质之间的相互作用关系。该网络包含36个节点和306个边,平均节点度为17。

图2 小承气汤治疗术后肠梗阻靶点PPI网络图

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 将小承气汤和术后肠梗阻的共有靶点基因输入David数据库,进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果显示,共有282个生物学过程被富集,主要包括对药物的反应、一氧化氮生物合成过程的正向调节、平滑肌细胞增殖的正向调节、趋化因子生物合成过程的正向调节等;34个分子生物学功能被富集,主要包括细胞因子活性、酶结合、生长因子活性、蛋白质同二聚活性等;28个细胞学组分被富集,主要包括细胞外空间、细胞外区域、质膜外侧等(见图3)。此外,共有10条 KEGG 信号通路被富集,按照P值从小到大排序,主要包括肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路等(见图4)。这些结果在图4中用气泡图表示,其中气泡的大小反映了该通路涉及的基因数量,颜色反映了富集显著性。

图3 小承气汤治疗术后肠梗阻靶点GO基因注释分析图

图4 小承气汤治疗术后肠梗阻靶点KEGG富集分析图

2.5 有效成分-靶点-信号通路网络图构建 采用Cytoscape 3.9.0 软件绘制小承气汤和术后肠梗阻的“有效成分-核心靶点-信号通路”网络图(见图5)。图5清晰地显示了小承气汤的31种有效成分、36个靶点蛋白和10条作用通路与术后肠梗阻的关联。

图5 小承气汤治疗术后肠梗阻“有效成分-靶点-信号通路”网络

3 讨论

术后肠梗阻是指腹部手术后肠道运动功能障碍或机械性阻塞,导致肠内容物不能正常通过的一种常见并发症。术后肠梗阻的治疗原则是及时诊断、纠正水电解质和酸碱平衡紊乱、消除感染和炎症、解除梗阻和恢复肠道功能[8]。治疗方法主要分为保守治疗和手术治疗。保守治疗适用于部分或不完全性梗阻,无绞窄或坏死的肠段,无明显腹膜炎体征或全身中毒症状的患者。保守治疗包括禁食水、胃肠减压、营养支持、维持水电解质、酸碱平衡、促进肠道蠕动、生长抑素、糖皮质激素、抗菌药物等西医措施,以及行气通腑、消积化滞等中药措施[9]。西医保守治疗可以为患者提供生命支持,纠正水电解质和酸碱平衡紊乱,消除感染和炎症,减少并发症。然而,其不能直接解除梗阻原因,可能延长肠道功能恢复时间,增加住院费用,部分患者可能需要再次手术。中药保守治疗可以根据患者的体质和证型进行个体化治疗,通过多途径给药,能够促进肠道功能恢复。然而,中药研究显示,小承气汤能够抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、降低血管通透性、保护胃肠功能等[10]。本文运用网络药理学方法,从有效成分、靶点、信号通路等方面分析了小承气汤治疗POI的可能机制。

从TCMSP数据库得到的小承气汤治疗术后肠梗阻的核心化合物有大黄酸(Rhein)、大黄素(Emodin)、芦荟大黄素(Aloe-emodin)、枸橼苦素(Poncimarin)、异枸橼苦素(Isoponcimarin)、新橙皮苷(Neohesperidin)等。现代药理学研究表明,大黄中富含大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等蒽醌类成分[11]。大黄素具有胆碱样作用,可兴奋平滑肌M胆碱受体,加快肠蠕动,同时可通过抑制巨噬细胞分泌的TNF2A,抑制过度的炎症反应[12]。大黄酸可显著抑制巨噬细胞内LTB4和LTC4的生物合成,同时抑制内毒素激发的巨噬细胞内钙离子升高,并提高细胞内 cAMP 水平,从而达到减轻或阻断炎症介质所导致的瀑布样效应[13]。此外,大黄酸、大黄素和芦荟大黄素均可通过抑制细菌的核酸和蛋白质的合成达到抗菌目的[14]。厚朴的主要成分为酚类物质,酚类含量最高、起主要药效的为厚朴酚与和厚朴酚[15]。厚朴酚是一种具有糖皮质激素样非选择性抗炎活性的化合物。药理研究发现,厚朴酚能够直接抑制iNOS、COX-2和5-LO的活性,从而阻断NO、PGs和LTs的合成和释放,厚朴酚还能够抑制组胺释放,进而发挥广谱的抗炎效果[16]。枳实中含有新橙皮苷等黄酮类成分[17],可改善FD大鼠的胃排空和肠蠕动[18],同时显著抑制COX-2、IL-6、TNF-α的表达,从而发挥抗炎作用[19]。

从PPI网络分析结果发现,小承气汤通过PPARG、IL-10、IL1B、NOS2、PTGS2、TNF等靶点共同发挥治疗作用。白介素10(Interleukin-10,IL-10) 是一种重要的抗炎细胞因子,可抑制过度的免疫反应以及炎症细胞因子的释放[20]。研究表明[21],IL-10在术后肠功能恢复中起着不可替代的作用,外源性IL-10可阻止其发生。预防性应用外源性重组人白细胞介素10可作为预防临床术后肠梗阻的一种治疗方法。肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor,TNF)是炎症反应的关键调节因子,可通过NF-κB和AP-1等通路,促进IL-1、IL-2、IL-6等炎性因子的激活[22]。研究表明,电针足三里(ST36)或足三里(ST36)联合天舒(ST25)可改善POI小鼠肠道运动,其机制可能与抑制TNF表达有关[23]。基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotein,MMP9)是一类蛋白酶,负责调控细胞外基质蛋白(ECMs)的降解和重构。在炎症过程中介导白细胞的迁移[24]。研究发现,MMP-9介导POI小鼠和大鼠肠肌内细胞炎症反应[25]。抑制MMP-9活性,可减少免疫细胞向肠肌的聚集,防止平滑肌收缩功能的丧失。

GO功能富集分析结果显示,小承气汤对术后肠梗阻的作用主要体现在以下方面：①生物学过程,包括趋化因子生物合成过程的正向调节、一氧化氮生物合成过程的正向调节、缺乏配体时的外源性凋亡信号通路、平滑肌细胞增殖的正向调节等;②分子功能,包括细胞因子活性、酶结合、生长因子活性等;③细胞组分,包括细胞外空间、细胞外区域、质膜外侧等。

KEGG通路富集分析结果显示,小承气汤对术后肠梗阻的作用主要涉及以下信号通路：①肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)是急性和慢性系统炎症反应的关键环节,能够通过激活下游的IKK/NF-κB和MAPK,诱导免疫和炎症反应[26]。研究表明,加味小承气汤能够显著降低硫代乙酰胺(TAA)所致肝损伤小鼠TNF-α水平,发挥细胞保护作用[27]。②T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)是免疫系统有效应答的关键事件,能够在T细胞受体特异性识别抗原提呈细胞表面MHC提呈的抗原肽后,通过蛋白激酶、衔接蛋白等多种分子相互作用,形成一系列级联反应,激活并诱导T细胞增殖和分化,参与免疫反应[28]。③HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)由缺氧诱导因子HIF-1调节。HIF-1是细胞代谢和缺氧所致细胞应激反应的重要转录调节因子,在炎症反应、生理应激等过程中发挥重要作用[29]。HIF与天然免疫的中枢调节因子NF-κB之间具有密切协同关系,HIF能够介导缺氧中性粒细胞NF-κB的活化,并以TLR-4依赖的方式促进LPS刺激巨噬细胞中NF-κB调节细胞因子的表达[30]。

本研究采用网络药理学方法,初步探讨了小承气汤治疗术后肠梗阻的可能机制。通过数据整合分析,发现小承气汤的多个成分作用于PPARG、IL-10、IL1B、NOS2、PTGS2、TNF等靶点,从而调节肿瘤坏死因子信号通路、T细胞受体信号通路等与免疫和炎症相关的信号通路。这一结果与以往的临床观察相符,支持了小承气汤治疗术后肠梗阻的有效性。此外,本研究还发现,小承气汤的部分靶点涉及细胞氧化应激和凋亡等过程,这为进一步揭示小承气汤的作用机制提供了新的线索。然而,网络药理学方法也存在一些不足。首先,该方法依赖于数据库和算法的质量,可能存在数据缺失、错误或过时的问题;其次,该方法只能进行定性分析,无法反映成分和靶点之间的定量关系;最后,该方法只能进行预测和推断,并不能取代实验验证和临床试验。因此,在后续的工作中,我们将对筛选出的关键靶点和通路进行实验验证,并进行更大规模和更长期的临床试验,以提高预测的精确度和可信度。