血浆hsa_circ_0094885在川崎病患儿中的表达水平及意义

董彤 韩勇 黄先玫

川崎病（kawasaki disease，KD）又被称为黏膜皮肤淋巴结综合征（mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS），是一种好发于4 个月~5 岁儿童的全身血管炎症性疾病，男孩较为多见［1-2］。KD 血管炎症性改变主要发生于全身的中小动脉，尤其是冠状动脉，主要表现为扩张、不同大小的冠状动脉瘤，严重时可有心肌缺血、血栓形成、心肌梗死、心包压塞、冠脉狭窄等，是目前发达国家获得性心脏病的主要原因［2］；发病机制可能是在某种病原体感染后触发了川崎病遗传易感性儿童免疫介导的炎症级联反应［3-4］。环状RNA（circular RNA，circRNA）在结构上是一类通过反向剪切形成闭合环状结构的单链非编码RNA，其与线性RNA 不同之处是circRNA 缺乏3’和5’端，而直接连接成环状结构［5］；circRNA 广泛分布于人体各个组织和细胞，具有种类丰富，表达稳定，高度保守，特异性强的特点［6］。目前研究已发现circRNA 通过调节转录过程和转录后调控，参与了多种疾病的发病机制，可作为多种疾病潜在诊断和判断预后的标记物，还可提供治疗靶点［7］。本文分析KD 急性期circRNA 与KD 相关实验室检查指标的相关性，探讨circRNA 对KD 的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019 年2 月至2020 年10 月杭州市第一人民医院KD 患儿。纳入标准：①均符合AHA2017 年修订的川崎病诊断标准；②年龄2 个月至6岁；③均为在杭州市第一人民医院首次诊断为KD 并完成治疗；④病例资料完整；⑤出院后长期随访；⑥排除合并有其他自身免疫性疾病或入院前使用过IVIG。同时选取同期因感染性疾病（发热≥5 d，明确有病原体感染或临床及实验室检查数据支持感染者，排除既往有KD 病史及KD 家族史者）和非感染性疾病（包茎、肝功能异常、矮小症等非感染疾病患儿）患儿为对照组。本研究共纳入患儿63 例，KD 组23 例，男12 例，女11 例；年龄（25.04±3.41）个月。感染组20 例，男10例，女10 例，年龄（30.6±3.65）个月。非感染组20例，男12 例，女8 例；年龄（29.85±2.61）个月。三组患儿一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经本院伦理会批准，患儿家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及耗材 （1）试剂：TRIzol（杭州欣耕生物科技有限公司，中国）、氯仿（上海沃凯生物有限公司，中国）、异丙醇（上海沃凯生物有限公司，中国）、75%乙醇（杭州欧拓普生物技术有限公司，中国）、逆转录试剂盒（TOYOBO，日本）、RNase R 试剂盒（广州吉赛生物科技公司，中国）、Real-Time PCR 试剂盒（bimake，美国）、RNase Free 水（QIAGEN，美国）、引物和内参（上海生工生物工程有限公司，中国）。（2）仪器：离心机（Thermo，美国）、涡旋振荡器（Vortex，美国）、移液枪（Thermo，美国）、恒温水浴箱（太仓精宏仪器设备有限公司，中国）、逆转录仪（BIO-RAD，美国）、NanoDrop 分光光度计（Thermo，美国）、荧光定量PCR 仪（ABI7500，新加坡）。

1.3 方法 （1）查找和筛选目的基因：先在GEO 数据库（http：//www.NCBI.nlm.nih.gov）检索与KD 相关的circRNA 表达谱，该数据的登录号为GSE64486；然后在CircBase 数据库（www.circbase.org）查找circRNA 的基因来源和序列信息。（2）收集标本：使用EDTA 抗凝管收集三组晨起空腹1.5~2.0 mL 外周静脉血。（3）分离血浆：将收集的静脉血离心，离心条件为4℃，3,000 r/min，离心10 min，离心结束后用移液枪吸取上清液即血浆分装在无RNA 酶EP 管内。（4）提取RNA ：使用TRIzol 法提取血浆中的总RNA，提取后使用NanoDrop 分光光度计对血浆总RNA 的浓度和纯度进行测量。（5）RNA 逆转录：先按RNase R 试剂盒说明书步骤去除血浆中的线性RNA，再将去除线性RNA 的血浆总RNA 按照TOYOBO qPCR RT 逆转录试剂盒说明书的要求在逆转录仪器上操作逆转录合成cDNA。（6）实时荧光定量PCR：将逆转录的cDNA 按照bimake 2xSYBR Green qPCR Master mix 试剂盒说明书步骤在ABI7500 仪器上进行实时荧光定量PCR 操作。目的基因circRNA 基因序列在circBase 进行查找，查找后按照circRNA 引物设计原则进行设计，由上海生工公司对引物进行合成。见表1。（7）qRT-PCR结果分析：circRNA 的相对定量采用2-△△Ct法进行分析，以GAPDH 作为内参照；其中，∆Ct=Ct（目的基因）-Ct［内参基因（GAPDH）］，△△Ct=实验组△Ct- 对照组△Ct，再取各组2-△△Ct即为相对表达量，∆Ct 值越大，提示circRNA 表达水平越低。

表1 circRNA引物序列

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0软件。符合正态分布计量资料以（±s）表示，两组比较采用两独立样本t检验，多样本平均数间的比较采用单因素方差分析；偏态分布计量资料以中位数［M（Q1，Q3）］表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskcal-Wailsh 检验；计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者操作特征曲线（ROC）和ROC 曲线下面积（AUC）评估circRNA 在KD中的诊断价值。

2 结果

2.1 血浆circRNA 在KD 组、感染组及非感染组中的表达情况 KD 组患儿血浆中hsa_circ_0094885 表达水平低于感染及非感染组（P<0.05）；血浆hsa_circ_0017348 表达水平在KD 组高于感染及非感染组（P<0.05）；KD 组血浆hsa_circ_0003609 低于非感染组（P<0.05）。见图1。

图1 三组患儿血浆circRNA的表达情况

2.2 血浆circRNA 在KD 急性期与恢复期中的表达情况 血 浆hsa_circ_0094885、hsa_circ_001640 和hsa_circ_0003609 在KD 急性期中表达水平均低于恢复期（P<0.05）。见图2。

图2 两组患儿血浆circRNA的表达情况

2.3 血浆circRNA 在各组中表达水平比较 KD 组血浆hsa_circ_0094885 表达水平低于感染组及非感染组（P<0.05）；KD 组血浆hsa_circ_0017348 表达水平高于感染组及非感染组（P<0.05）。见表2。KD 急性期血浆hsa_circ_0094885 表达水平低于恢复期表达水平（P<0.05）。见表3。

表2 三组血浆hsa_circ_0094885及hsa_circ_0017348表达水平比较（±s）

表2 三组血浆hsa_circ_0094885及hsa_circ_0017348表达水平比较（±s）

注：与感染组比较，*P<0.05；与非感染组比较，#P<0.05

指标 感染组（n=20）非感染组（n=20）KD 组（n=23） H 值 P 值hsa_circ_0094885 1.41±0.18 1.40±0.20 0.51±0.19*# 26.438 <0.001 hsa_circ_0017348 2.94±0.41 0.39±0.03 10.29±2.90*# 8.974 <0.05

表3 KD急性期与恢复期血浆hsa_circ_0094885表达水平比较（±s）

表3 KD急性期与恢复期血浆hsa_circ_0094885表达水平比较（±s）

时间急性期恢复期t 值P 值hsa_circ_00948850.43±0.03 2.02±0.90-2.38<0.05

2.4 hsa_circ_0094885 在KD 中潜在诊断价值 采用ROC 曲线评估血浆hsa_circ_0094885 的诊断效能，结果显示：血浆hsa_circ_0094885 的ROC 曲线下面积为0.763，标准误0.072，95%置信区间0.621~0.905，截断值是0.46，敏感度为78.26%，特异度为78.57%。见图3。

图3 血浆hsa_circ_0094885对KD的ROC分析

3 讨论

KD 的诊断主要依靠KD 特征性临床表现、一般实验室检查及心脏超声检查［8］。近年来，随着分子生物学的发展，越来越多的非编码RNA 可能参与KD 的发病以及可作为KD 的诊断标志物。circRNA 作为近几年来的热点之一，被越来越多的学者发现其与诸多疾病的发生发展具有一定的相关性［9-12］。在心血管疾病中既往研究发现外周血中hsa_circ_0082081 与hsa_circ_0124644可能是冠状动脉疾病的诊断标志物，尤其是两者结合起来诊断效能更高［13］。此外，急性期KD 患儿血清circ_ANRIL 表达水平与健康对照组相比明显上调，经IVIG治疗后明显下降［14］。

本研究显示，KD 组急性期血浆hsa_circ_0094885表达水平低于感染组及非感染组（P<0.05），经过治疗后KD 患儿恢复期血浆hsa_circ_0094885 水平上调，提示hsa_circ_0094885 可能与KD 的发生相关；KD 患儿急性期血浆hsa_circ_0017348表达水平高于感染组及非感染组（P<0.05），经治疗后KD 患儿恢复期hsa_circ_0017348表达水平无明显变化，因此hsa_circ_0017348 与KD 是否具有相关性不明确；血浆hsa_circ_0003609 和hsa_circ_001640 在三组中表达水平差异无无统计学意义，因此hsa_circ_0003609 和hsa_circ_001640 可能与KD 发生无关。

以往研究发现，hsa_circ_0094885 为circ_ATM，其基因位点在chr11：108098332-108100050，ATM 主要在DNA 修复和细胞周期调节中发挥重要作用，其编码的蛋白属于PI3/PI4 激酶家族，是多种下游蛋白包括P53、BRCA1、CHK2、RAD17 等的调节因子，此外，ATM 已经被证明其发生突变可导致共济失调毛细血管扩张［15］，然而也有较多研究证明ATM 基因多态性与肺癌、放射性肺炎、乳腺癌等有关［16］，可作为这些疾病的早期预测因子。通过ROC 曲线对血hsa_circ_0094885 的诊断效能进行评估，结果显示AUC 为0.763，敏感度为78.26%，特异度为78.57%，表明血浆hsa_circ_0094885在KD 诊断中具有较高的敏感度和特异度，进一步提示hsa_circ_0094885 有望成为诊断KD 的新型生物学标志物。