夏枯草乙酸乙酯提取物对一氧化氮合酶作用的研究

郑洋滨，洪燕，龚玮，周年，刘宁

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

夏枯草主要有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血压等药理作用［1］，具有清火除热，清肝明目，散结消肿等功效［2］，可有效扩张血管，具有良好的降压效果［3］。在前期的研究中发现，夏枯草乙酸乙酯提取物有内皮依赖性血管舒张作用，且其血管舒张作用与一氧化氮（NO）的释放和一氧化氮合酶（NOS）的调节有关［4］。夏枯草乙酸乙酯提取物多为挥发油、萜类、黄酮、甾醇类和香豆素类。已有文献［5-6］报道夏枯草中的黄酮类化合物主要有山柰酚、槲皮素、芦丁等，均是有明确舒张血管作用的化合物，均能导致内皮依赖性大鼠胸主动脉舒张。为了进一步阐明夏枯草乙酸乙酯提取物的降压机制，本课题组对其在内皮细胞中的作用机制进行更深入研究。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞融合细胞（EA·hy926），购自上海语纯生物科技有限公司。

1.2 实验样品及主要试剂

夏枯草药材购自毫州市中信中药饮片厂，批号：1 904001；人内皮型一氧化氮合酶（eNOS）测定剂盒（上海泛柯实业有限公司，货号：F0465-B）；NO 测定试剂盒（碧云天生物技术公司，货号：NOS0021S）；BCA 蛋白检测试剂盒（碧云天生物技术公司，货号：NO.P0012S）；兔抗人窖蛋白-1（Cav-1）多克隆抗体（批号：0209500101），兔抗人内皮型一氧化氮合酶（eNOS）多克隆抗体（批号：5500004931），兔抗人磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）多克隆抗体（批号：2101760101），兔抗人热激蛋白90（HSP-90）多克隆抗体（批号：4000001169）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；小鼠抗人β-action（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号：#37u8343），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（批号：22221），辣根酶标记山羊抗兔IgG（批号：20121）均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 实验仪器

MB614S 电子天平（d=0.1mg），PowerPacTM Basic电泳仪，IC1000 细胞计数器，ChemiDoc MP 凝胶成像仪，MULTISKAN GO 酶标仪。

1.4 实验方法

1.4.1 试验样品配制 称取夏枯草乙酸乙酯干浸膏2.03 g 加二甲基亚砜（DMSO）10 mL 溶解为母液。用DMEM 培养基将母液稀释至1 500.00、1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.20、15.60 μg/mL的样品。

1.4.2 细胞毒性试验 取对数生长期细胞，按每孔1×104个细胞接种于96 孔板。待细胞铺满80%，加入“1.4.1”项下样品，空白对照组给予5‰DMSO的培养基，每组设8 个复孔。24 h 后每孔加入MTT 20 μL，CO2培养箱孵育4 h，弃去孔内液体，每孔加DMSO150 μL 溶解，振荡10 min，在570 nm和630 nm 双波长下测定吸光度。计算相对增殖度（RGR），RGR=实验组吸光度/空白对照组吸光度×100%。RGR ≥80%则认为无细胞毒性作用［7］。

1.4.3 对NO 浓度和NOS 含量的影响 取对数生长期细胞，按每孔5×105个细胞接种于6 孔板。待细胞铺满80%，加入31.20、15.60、7.80 μg/mL 的样品作为高、中、低剂量组，阴性对照组给予5‰DMSO的培养基。24 h 后收集上清液，检测细胞外NO 含量，每组重复测定8 次。将6 孔板置于冰上，每孔加4 ℃预冷PBS 洗涤3 次，再加200 μL 细胞裂解液，用枪吹打数下，将裂解液和细胞碎片转移至1.5 mL的离心管中，14 000 g 离心5 min，离心半径7 cm。取上清液检测细胞内NO 和eNOS 含量，每组重复测定8 次。

1.4.4 Western blot 检测蛋白表达 BCA 蛋白测定试剂盒检测细胞裂解液中蛋白质含量，取等量蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，而后将蛋白转印至PVDF 膜上，封闭液孵育1 h 后，根据marker 标记剪取目的蛋白eNOS、p-eNOS、HSP-90 和Cav-1 的条带，分别加入经1∶500 稀释后的兔抗人eNOS、p-eNOS、HSP-90、Cav-1 多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。洗膜后用1∶2 000 稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG 在脱色摇床上室温孵育1 h。孵育后的PVDF 膜经3 次洗涤，加入显色剂显色，在凝胶成像系统中拍照，采用Image J 软件对目的蛋白进行灰度分析［8］，重复试验3 次。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 MTT 实验结果

实验结果表明，当夏枯草乙酸乙酯提取物浓度大于31.20 μg/mL 时，会影响EA·hy926 的增殖度，见图1。故后续实验选择31.20、15.60、7.80 μg/mL作为高、中、低剂量组。

图1 夏枯草乙酸乙酯提取物MTT实验结果

2.2 对NO 释放量及eNOS 含量的影响

中、高剂量组细胞内NO 和eNOS 含量高于阴性对照组（P＜0.05）。高、中、低三个剂量组对细胞外NO 含量均无明显变化（P＞0.05），见表1。

表1 夏枯草乙酸乙酯提取物对NO释放量及eNOS含量的影响（，n=8）

表1 夏枯草乙酸乙酯提取物对NO释放量及eNOS含量的影响（，n=8）

注：与阴性对照组比较，aP＜0.05；eNOS，内皮型一氧化氮合酶；NO，一氧化氮。

2.3 对相关蛋白表达的影响

中、高剂量组细胞内eNOS 和HSP-90 的蛋白表达均高于阴性对照组（P＜0.05），Cav-1 的蛋白表达均低于阴性对照组（P＜0.05）。高剂量组p-eNOS 蛋白表达高于阴性对照组（P＜0.05）。见表2、图2。

表2 夏枯草乙酸乙酯提取物对eNOS、p-eNOS、Cav-1和HSP-90蛋白表达的影响（，n=3）

表2 夏枯草乙酸乙酯提取物对eNOS、p-eNOS、Cav-1和HSP-90蛋白表达的影响（，n=3）

注：表格数据为各蛋白灰度值，以β-actin为对照；与阴性对照组比较，aP＜0.05；eNOS，内皮型一氧化氮合酶；p-eNOS，磷酸化内皮型一氧化氮合酶；Cav-1，窖蛋白-1；HSP-90，热激蛋白90。

图2 夏枯草乙酸乙酯提取物对相关蛋白表达的影响

3 讨论

Cav-1 是胞膜窖的膜整合蛋白，主要分布于内皮细胞、平滑肌细胞等细胞中，负责调控众多定位于胞膜窖的信号分子的活性。在静息状态下，eNOS与Cav-1 结合，处于失活状态，当细胞受外界信号刺激时，eNOS 与Cav-1 分离，eNOS 被激活，从而产生NO［9-12］。HSP-90 作为分子伴侣蛋白，细胞受外界信号刺激时，HSP-90 会占据eNOS 上的Cav-1结合位点，eNOS 与HSP-90 的结合促进了Akt 的聚集，Akt 使eNOS 的Ser1179 和Thr497 磷酸化，促进eNOS 释放NO，舒张血管，降低血压。因此，降低Cav-1 表达，增加HSP-90 表达，可以促进eNOS 释放NO［13-15］。

本次实验结果表明，夏枯草乙酸乙酯提取物能增加细胞内eNOS 含量，促进NO 释放，其通过提高EA·hy926 内eNOS 和p-eNOS 的蛋白表达，增加细胞内eNOS 的含量和活性，使NO 释放增多。此外夏枯草乙酸乙酯提取物还能增加HSP-90 的蛋白表达，降低Cav-1 的蛋白表达，使eNOS 与HSP-90 结合增多，促进eNOS 磷酸化，增加NO 的释放。然而，本次实验未对夏枯草乙酸乙酯提取物进行进一步的分离、纯化；因此，夏枯草提取物中具体哪一类化合物起到增加NO 释放作用将是课题组未来的研究方向。

综上所述，夏枯草乙酸乙酯提取物的舒张血管作用与增加血管内皮细胞的NO 释放有关，其能够通过增加血管内皮细胞内eNOS、p-eNOS 和HSP-90 的蛋白表达，降低Cav-1 的蛋白表达，增加细胞内eNOS 的含量和活性，促进eNOS 释放NO，从而舒张血管，降低血压。本次实验基本阐明了夏枯草乙酸乙酯提取物在内皮细胞中的作用机制，为夏枯草进一步的开发利用提供理论基础。