根系分泌物对生物强化修复PAHs污染土壤的影响

李瑜婷,鲍文秀,张 闻,王加宁,黄玉杰,宋繁永

根系分泌物对生物强化修复PAHs污染土壤的影响

李瑜婷,鲍文秀,张 闻*,王加宁,黄玉杰,宋繁永

(齐鲁工业大学(山东省科学院),山东省科学院生态研究所,山东省应用微生物重点实验室,山东 济南 250103)

通过土壤微宇宙实验,探究了生物强化对多环芳烃(PAHs)污染土壤的修复效果及根系分泌物对生物强化修复的影响.结果表明,向土壤中接种PAHs降解菌群(布鲁氏菌(sp.)、苍白杆菌(sp.)、鞘脂单胞菌(sp.)、克雷伯氏菌(sp.)和不动杆菌(sp.))21d后, PAHs残留量较对照下降了15.8%;在此基础上添加黑麦草实际或模拟根系分泌物均显著增强了生物强化修复效果, PAHs残留量较对照分别下降了26.3%和24.6%. 3种生物强化措施均改变了细菌群落结构,其中添加根系分泌物后的处理细菌群落结构的改变更大,芳烃降解基因丰度增加得更多,显示根系分泌物通过促进PAHs降解菌的生长影响细菌群落从而提升生物强化修复效果.两类根系分泌物对细菌群落影响的差别未引发其对生物强化促进效果的差异.该研究可为优化有机污染土壤生物强化修复技术提供参考.

多环芳烃；土壤修复；黑麦草；根系分泌物；生物强化

多环芳烃(PAHs)是一类具有致癌性、致畸性、致突变性以及环境持久性等特点的有机污染物[1-2],稳定的化学性质和疏水特性使其易于积累于土壤环境中,影响土壤的生态功能和农作物的生产质量,并可能进入食物链对人类健康造成风险[3].在PAHs污染土壤诸多修复技术中,生物修复因环境友好、成本较低等优点受到了广泛关注[4].植物-微生物联合修复是结合了植物根际修复和专性降解菌生物强化优势的一种生物修复方法,主要利用植物根系分泌物对降解微生物的降解强化作用,加速土壤PAHs的污染修复进程[5-6].根际土壤中植物的根系分泌物可通过提供丰富的营养或共代谢底物,提高土壤微生物的数量和活性,促进PAHs的微生物降解[7-8].土壤中的微生物群落是影响PAHs生物修复效果的关键因素,群落优势物种组成、多样性及结构的变化会引发土壤生态系统中微生物群落功能和代谢的变化,进而影响PAHs的去除[9-11].

不同植物的根系分泌物组分具有特异性,且植物受生长周期、温度、土壤性质等因素影响,根系分泌物组分及分泌量会发生变化,作用范围随着离根系距离的增加而递减,使得根际效应具有复杂性,不易直接评估根系分泌物的作用.为厘清根系分泌物在植物-微生物联合修复中的作用机制,有学者通过种植植物获取确定组分和浓度的根系分泌物后,与外源专性降解菌同时直接投加至土壤,研究其对 PAHs 污染土壤微生物的影响,对PAHs去除效率的提高提出了多种作用机制,认为细菌群落结构的改变[12]及外源菌降解活性的增强[5]可促进PAHs的降解.目前相关研究较为有限,投加的降解菌多为单一PAHs降解菌株,但实际污染场地生物强化修复一般使用具有协同作用的降解菌群.外源菌群进入污染土壤后会与土著菌群竞争生长.课题组前期研究了根系分泌物对于芘污染土壤中土著细菌群落的影响,发现其对细菌群落的丰富度和多样性影响不大,但对群落结构的影响较为显著,促进了土著PAHs降解菌的生长及部分功能基因丰度的增加.当外源菌群与土著菌群竞争共存时,根系分泌物对整体土壤微生物群落产生怎样的影响,鲜有报道,有必要明确.

假设外源菌群进入污染土壤后与土著菌群共存,共同发挥PAHs降解作用;添加根系分泌物可能会影响整体土壤细菌群落的结构和功能,进而影响其降解作用的发挥.基于此,本文选用课题组前期筛选获得的PAHs高效降解菌群,对PAHs污染土壤进行生物强化修复,同时投加黑麦草实际根系分泌物,研究根系分泌物对生物强化效果及土壤细菌群落结构及功能的影响;配制相同浓度、配方明确的模拟根系分泌物与实际根系分泌物进行对比研究,探讨两类根系分泌物作用的异同,考察模拟根系分泌物在土壤修复工程中辅助应用的可行性.研究结果可为明确根系分泌物在植物-微生物联合修复PAHs污染土壤的作用机制、优化PAHs污染土壤生物修复技术提供参考.

1 材料与方法

1.1 PAHs和植物

根据PAHs污染土壤相关研究[13-15],土壤中PAHs以三、四及五环芳烃居多,本文选取三环芳烃菲(PHE)、四环芳烃芘(PYR)和五环芳烃苯并[a]芘(BAP)为代表性PAHs进行研究,纯度分别大于98.0%、98.0%和96.0%.供试植物为常用于PAHs污染土壤修复的多年生黑麦草(L.).

1.2 土壤

实验土壤采自山东省济南市(36.71N, 117.07E),土地类型为棕壤,其基本理化性质如下: pH = 8.25,有机质含量为52.1g/kg,全氮、全磷及全钾含量分别为2.28, 0.96和13.0g/kg,阳离子交换量为22.6cmol/kg.根据文献报道土壤中PAHs污染水平、种类及占比[16-17],设置土壤中总PAHs初始污染水平为40mg/kg, 其中PHE:PYR:BAP质量比为2:2:1.称取适量土壤,加入PAHs-丙酮储备液,搅拌均匀,置于通风橱中挥发丙酮,之后用于实验.

1.3 根系分泌物

选取黑麦草根系分泌物和模拟根系分泌物进行对比研究.黑麦草根系分泌物通过水培法获取,具体操作参照先前研究[18-19]并稍作修改.将黑麦草种子置于3% H2O2溶液中消毒20min,使用无菌水冲洗3次,并在无菌水中浸泡过夜.称取40g浸泡过的种子,平铺于育种盘,加入1L超纯水,置于培养箱中培养(光暗比,16h:8h;温度,25℃:20℃).种子萌发3d后,将超纯水置换为1L的半量霍格兰氏(Hoagland’s)营养液,置于培养箱中继续培养15d,每5d更换一次营养液.之后取出整板黑麦草,使用超纯水冲洗根部,将原育种盘更换为玻璃盘以避免根系分泌物的吸附损失,加入1L超纯水,在培养箱中避光收集根系分泌物24h.玻璃盘中溶液过0.45μm水系滤膜即获得黑麦草根系分泌物.通过冷冻干燥机进行低温干燥,获得根系分泌物固体,置于4℃冰箱储存备用.

模拟根系分泌物依据文献配制[20-21],包含实际植物根系分泌物中常见的含碳化合物,具体组分为:葡萄糖、果糖和蔗糖,各50mmol/L;琥珀酸和苹果酸,各25mmol/L;丝氨酸、精氨酸和半胱氨酸,各12.5mmol/L.

1.4 PAHs降解菌群

课题组前期保藏了5株PAHs高效降解菌株,分别为布鲁氏菌(sp.)、苍白杆菌(sp.)、鞘脂单胞菌(sp.)、克雷伯氏菌(sp.)和不动杆菌(sp.),均属于变形杆菌门(Proteobacteria).其配伍菌群在7d内的PAHs降解率可达24.3%,其中对PHE、PYR和BAP的降解率分别为23.3%, 26.4%和19.6% (50mg/L的PAHs-无机盐液体培养基, PHE:PYR:BAP = 10:10:1)[22].本研究以此菌群对PAHs污染土壤进行生物强化修复.

各单菌菌株分别在牛肉膏蛋白胨固体培养基(LB干粉20.0g,琼脂20.0g,1L去离子水,121℃高压灭菌20min)上划线活化,于生化培养箱中30℃培养72h.分别挑取单菌落至扩大培养基(营养肉汤18.0g, 1L去离子水, 121℃高压灭菌20min)中,于摇床中30℃、150r/min培养24h.菌液在4℃、8000r/min下离心5min,弃去上清液,加入PBS溶液重悬(NaCl 8.0081g, KCl 0.2734g, Na2HPO41.1502g, KH2PO40.2394g,无菌水定容至 1L, pH =7. 0, 121℃高压灭菌20min),制得菌悬液备用.使用稀释平板计数法测得每mL菌悬液的活菌数为1.55×1010个菌落形成单位(CFU).

1.5 土壤修复实验设计

分别称取15g土壤于多个棕色玻璃瓶中,进行如下处理: (1)自然衰减处理,命名为CK,作为对照组; (2)生物强化处理,接种PAHs降解菌群,命名为MC; (3)生物强化+实际根系分泌物处理,接种PAHs降解菌群并添加黑麦草根系分泌物,命名为MRE; (4)生物强化+模拟根系分泌物处理,接种PAHs降解菌群并添加模拟根系分泌物,命名为MARE.以上处理中所涉及的PAHs降解菌悬液投加体积均为2mL,根系分泌物及模拟根系分泌物浓度均为120mg C/kg.各处理组均设置3平行.调整每个瓶中土壤含水率为最大田间持水量的60%,封瓶膜封口后置于光照培养箱中25℃培养21d,每7d采用称重法补水.分别在0、14d和21d取土样,测定PAHs的残留量;对第21d土样,同时提取土壤DNA进行16S rDNA扩增子测序.

1.6 土壤中PAHs的测定

称取2g土壤于棕色玻璃瓶中,加入 10mL二氯甲烷,涡旋3min后,超声萃取10min(功率500w), 3000r/min离心10min,获得上层有机相.重复萃取3次,合并有机相,加入无水Na2SO4脱水,旋蒸至近干,用甲醇定容至4mL.通过0.45µm尼龙滤膜后,使用1260HPLC(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)测定PAHs浓度.色谱柱为安捷伦 Infinity Lab Poro shell 120EC-C18(4.6mm×100mm,2.7µm),柱温 25℃.流动相为甲醇和水(9:1),流速1.0mL/min,进样量为50µL,检测时长为8.0min.采用DAD 检测器,PHE、PYR和BAP的检测波长分别为251nm、240nm和296nm.

1.7 土壤DNA的提取及16S rDNA扩增子测序

采用CTAB法[23]从土壤样本中提取基因组DNA,对16S rDNA的V3～V4区进行PCR扩增.扩增引物为341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3').PCR产物经电泳检测后,对目的条带进行回收和文库构建.通过Novogene(中国北京)的Illumina NovaSeq测序平台进行测序.针对测序得到的双端reads,进行拼接、过滤和降噪,可对得到的有效数据ASVs (Amplicon Sequence Variants,即扩增子序列变异)进行后续分析.使用QIIME2软件中的classify-sklearn模块比对得到每个ASV的物种信息,计算goods_ coverage、observed_features、chao1、pielou_e和shannon等Alpha多样性指数、加权和非加权 unifrac距离和Bray-Curtis距离.通过基于加权unifrac距离的主坐标分析(PCoA)和无度量多维标定法(NMDS)探究各组间Beta多样性的差异.采用基于线性判别分析(LDA)效应量的分析方法(LEfSe),寻找组间具有统计学差异的细菌物种.使用PICRUSt2软件对样本中的微生物群落进行功能预测分析.基于京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库和BioCyc子数据(MetaCyc)进行细菌功能注释,生成了包含KEGG 直系同源物(KO)和MetaCyc Pathways(PWY)的绝对丰度和相对丰度的预测表.采用基于Bray-Curtis距离的主成分分析(PCA)探究不同样本中功能基因家族预测组成的差异.

1.8 数据统计分析

以土壤中PHE、PYR、BAP以及三者之和(总PAHs)的残留含量作为生物强化修复的评价指标,各处理组中PAHs残留量以三平行的平均值来表示.各组之间的数据差异采用ANOVA分析进行比较(SPSS 21.0软件).事先进行方差齐性检验,方差相等时采用LSD法,方差不相等时采用Tamhanes’ T2法.使用Origin 2022b软件绘图.

2 结果与分析

2.1 PAHs污染土壤的生物强化修复效果

各处理组土壤中PAHs的残留量见图1.修复21d后, CK、MC、MRE和MARE组中总PAHs残留量分别为5.7, 4.8, 4.2和4.3mg/kg. 3种生物强化处理后PAHs残留量较对照组下降了15.8%, 26.3%和24.6% (图1(A)).在所研究的时间点14d和21d时,生物强化处理MC表现出了显著优于对照组的修复效果,总PAHs残留量显著低于CK组1.3～2.4mg/kg (<0.05).添加了根系分泌物的生物强化处理(MRE和MARE组)较未添加根系分泌物的处理(MC组)修复效果更优,根系分泌物的添加使得土壤中PAHs含量进一步显著减少,较MC分别减少了1.3～ 2.0mg/kg (14d)和0.5～0.6mg/kg (21d).添加了黑麦草实际根系分泌物的生物强化处理组与模拟根系分泌物强化处理组相比较,二者的PAHs残留量无显著差异.对于单一PAHs (PHE、PYR和BAP)而言, 4个处理组的污染物残留量顺序与总PAHs一致,为MRE≈MARE < MC < CK.

修复14d时, 3种生物强化处理使得土壤中的PAHs残留量比对照组减少了2.4～4.4mg/kg,随着修复的进行,生物强化处理较CK的优势减弱, 21d时PAHs残留量与对照组的差值降至0.9～1.6mg/kg.这表明,生物强化在修复初期的效果最显著,随着自然衰减的进行,土壤中污染物量的降低,生物强化处理与对照组之间的差异逐渐减小.

图1 土壤中PAH的残留含量

柱高为三个平行样中残留含量的平均值,误差线表示标准偏差.不同小写字母表示在该时间节点时不同处理组间差异的显著性(<0.05)

2.2 PAHs污染土壤的细菌群落

2.2.1 土壤细菌群落组成 比较了各处理组土壤细菌群落组成.各样本ASVs数量韦恩图见图2(A).根据物种注释结果,选取门和目水平上相对丰度前30的物种得到物种相对丰度柱形图(图2(B)和(C)).对比了门水平上各组间优势物种组成. CK组主要优势门为放线菌门(Actinobacteriota, 33.3%)、变形菌门(Proteobacteria, 29.0%)、厚壁菌门(Firmicutes, 7.6%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadota, 7.5%)、拟杆菌门(Bacteroidota, 7.1%)和酸杆菌门(Acidobacteriota, 5.0%). 3种生物强化处理均向土壤中接种了PAHs降解菌群,菌群中5株单菌均属于变形菌门(Proteobacteria).图2显示该菌门在土壤中占据了绝对的丰度优势,在 MC、MRE和MARE组中相对丰度分别较CK高出11.5%, 10.3%和8.0%,说明接种PAHs降解菌群21d后,降解菌未被土著菌竞争淘汰.接种外源降解菌引发了其他菌门相对丰度的改变,粘球菌门(Myxococcota)的相对丰度由2.3%增至2.4%～2.9%;疣微菌门(Verrucomicrobiota)的相对丰度由1.5%增至1.8%～3.3%;其余门相对丰度则有所减少,其中放线菌门(Actinobacteriota)减少得最多,相对丰度在MC、MRE和MARE组中分别减少了12.9%, 9.9%和7.7%.

目水平上各组间优势物种组成结果如图2(C)所示.CK组中前30优势菌目的相对丰度在0.1%～ 9.7%范围内,其中微球菌目(Micrococcales)的相对丰度最大,为9.7%,其次为芽单胞菌目(Gemmatimonadales, 6.7%)、伯克氏菌目(Burkholderiales,5.6%)、根瘤菌目(Rhizobiales,5.5%)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales, 5.4%)和小单孢菌(Micromonosporales,5.3%).生物强化处理未改变优势菌目的种类,但引发了部分菌目相对丰度的变化.PAHs外源降解菌群中5株菌属于4个目,分别为根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、肠杆菌目(Enterobacterales)和假单胞菌目(Pseudomonadales).向土壤中投加PAHs降解菌群后,原本为前10优势菌目的根瘤菌目(Rhizobiales)和鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)相对丰度进一步增加,分别增至7.1%～13.1% 和5.5%～6.6%.肠杆菌目(Enterobacterales)和假单胞菌目(Pseudomonadales)在CK组中相对丰度排第28和第30,为0.1%和0.7%.肠杆菌目(Enterobacterales)丰度在3种生物强化处理后由0.1%增至0.4%～1.1%;假单胞菌目(Pseudomonadales)只在MC和MRE处理组中相对丰度增加,为0.8%和1.3%,而在MARE组中丰度降低至0.5%.伯克氏菌目(Burkholderiales)、芽孢杆菌目(Bacillales)和黄单胞菌目(Xanthomonadales)为土壤中相对丰度排名前10的优势土著菌目,本研究所接种的外源降解菌群中并未含有这些菌目,但生物强化处理后以上土著菌目的相对丰度仍有不同程度地增加,分别增加了0.1%～1.3%、1.3%～11.5%和2.2%～11.5%.

图2 土壤细菌群落中ASVs数目及优势菌门、目的相对丰度

图(B)和(C)中的“Others”表示图中所示物种之外其他所有门或目的相对丰度之和

2.2.2 土壤细菌群落多样性 比较了各组Alpha多样性分析指数,结果见表1.测序深度指数(goods_ coverage)均接近于1,表明测序数据量合理,序列信息可反映样本群落的真实信息.只接种外源降解菌群即MC处理未显著影响可观察到的物种数目(observed_features)及物种丰富度(chao1),添加根系分泌物同时接种外源菌群即MRE和MARE处理使得这2个指数降低, observed_features指数降低至1308～1486, chao1指数降低至1310～1488. 3种生物强化处理使得土壤细菌群落均匀度(pielou_e)和群落多样性(shannon)与CK相比均不同程度地降低,分别降至0.833～0.880和8.622～9.271.其中MARE处理降低得更显著.

对比了各处理组Beta多样性组间差异,使用基于加权Unifrac 距离的PCoA和NMDS分析方法,结果见图3.图3(A)中PC1和PC2轴对差异的贡献率分别为32.76%和22.71%, 3种生物强化处理MC、MRE和MARE组的样本点均在CK组样本点的左下方,与CK组不重合,说明生物强化显著改变了土壤细菌群落的结构.MC组与MRE和MARE组的样本点分散开来,表明添加根系分泌物影响了接种外源菌群后的土壤细菌群落结构. NMDS分析结果佐证了以上结论(图3(B), stress=0.1).

2.2.3 差异物种 为探究各处理组间土壤细菌群落中丰度差异显著的物种类别,使用LEfse分析两两比较CK与各处理组中物种的相对丰度(LDA阈值=4),结果见图4(A)～(C). MC、MRE和MARE组中分别显著富集了5、5和8个物种. MC与CK组相比较, MC土壤中富集了α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria),微孢子科(Microscillaceae),根瘤菌科(Rhizobiaceae),噬纤维菌目(Cytophagales)和根瘤菌目(Rhizobiales),而只有微球菌目(Mircrococcales)在CK组中被显著富集.经过MRE处理后, Diplorickettsiaceae 科(Diplorickettsiaceae), Diplorickettsiales目(Diplorickettsiales),黄单胞菌科(Xanthomonadaceae),黄单胞菌目(Xanthomonadales)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)丰度显著增加;而微球菌科(Micrococcaceae),微球菌目(Micrococcales)和放线菌纲(Actinobacteria)则在CK组中相对丰度显著增加. MARE处理组中富集的土壤细菌物种个数最多,分别为芽孢杆菌科(Bacillaceae),芽孢杆菌目(Bacillales),芽孢杆菌纲(Bacilli), 根瘤菌科(Rhizobiaceae),根瘤菌目(Rhizobiales),黄单胞菌科(Xanthomonadaceae),黄单胞菌目(Xanthomonadales)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria);富集在CK组中的主要物种为芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae),芽单胞菌目(Gemmatimonadales)和芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes).在上述差异物种中,MC和MARE组的共同差异物种为根瘤菌科(Rhizobiaceae)和根瘤菌目(Rhizobiales); MRE和MARE组的共同差异物种为黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria); MC和MRE组中未出现丰度显著增加的共同物种.

表1 土壤细菌群落的Alpha多样性指数

注:不同小写字母表示针对同一Alpha多样性指数各处理组间差异的显著性.

图3 基于加权unifrac距离的土壤细菌群落Beta多样性

为进一步探究不同生物强化措施产生的差异物种,比较了MC、MRE和MARE组土壤细菌的相对丰度(LDA阈值=3),得到的差异物种系统发育树见图4(D). MC组中富集了薄层菌科(Hymenobacteraceae)、乳杆菌目(Lactobacillales)和根瘤菌科(Rhizobiaceae)的细菌; MRE组中AKYG1722科、Diplorickettsiaceae科和Diplorickettsiales目的相对丰度增加最为显著; MARE组中的差异物种为芽孢杆菌纲(Bacilli)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)和西索恩氏菌目(Chthoniobacterales).

图4 组间线性判别的效应量分析(LEfse)

图(A)～(C)中LDA阈值=4; 图(D)中LDA阈值=3

2.2.4 细菌群落功能预测 基于16S rDNA基因序列使用PICRUSt2预测土壤样本的细菌群落功能,并归类至KEGG数据库和MetaCyc数据库. PICRUSt2与以往常用的PICRUSt相比,精度大幅提升,其数据库中的物种分类学种水平增加近5倍,基因组增加至10倍以上,功能预测信息更加全面[24].样品在KEGG数据库中Level 1层级的功能注释结果显示,所有样本中归属于新陈代谢功能的基因种类最多,其次为环境信息处理和细胞过程等相关功能.所有处理组的共有功能基因有6733个,特有功能基因数目顺序为: CK > MRE > MC > MARE(图5(A)).各处理组中细菌功能PCA分析如图5(B)所示, PC1和PC2轴的贡献率分别为26.49%和24.79%. 3种生物强化处理组样本点在CK组样本点的下方,且距离较远,说明生物强化处理影响了土壤细菌群落的功能.MC组和MARE组之间的距离较其与MRE组之间的距离稍远,说明在接种外源菌群的情况下,添加模拟根系分泌物较实际根系分泌物对细菌群落功能改变的程度更大.

除KEGG数据库外,本文还采用MetaCyc数据库注释了16S rDNA基因序列预测群落功能. MetaCyc数据库是由大量源于科学实验和文献的数据阐明的代谢通路数据库,与KEGG数据库相比,其包含的初级和次级代谢途径更为全面,可用来预测基因组中的代谢途径[25].选取相对丰度排名前35的代谢通路涉及的基因及它们在每组样品中的丰度信息绘制热图,并从功能差异层面进行聚类,结果如图5(C)所示.与CK相比, MC组中相对丰度较大的途径主要为L-异亮氨酸生物合成I的超途径(PWY- 3001, superpathway of L-isoleucine biosynthesis I)和5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成I(PWY-6121, 5-aminoimidazole ribonucleotide biosynthesis I); MRE组中脂肪酸补救合成(PWY-7094, fatty acid salvage)、脂肪酸&β;-氧化 I(FAO-PWY, fatty acid β-oxidation I)、腺苷核苷酸生物合成的超途径I(PWY-7229,superpathway of adenosine nucleotides de novo biosynthesis I)、原核生物的TCA循环I(TCA,TCA cycle I (prokaryotic))、细胞色素c的有氧呼吸I(PWY-3781, aerobic respiration I (cytochrome c))和腺苷核苷酸从头生物合成的超途径II(PWY-6126, superpathway of adenosine nucleotides de novo biosynthesis II)等功能较为丰富; MARE组中TCA 循环 IV(P105-PWY, TCA cycle IV (2-oxoglutarate decarboxylase))和TCA循环VIII(REDCITCYC, TCA cycle VIII (helicobacter))功能的丰度较大.即MC处理强化了氨基酸、核苷和核苷酸生物合成等相关过程; MRE处理使脂肪酸和脂质生物合成及降解、核苷和核苷酸生物合成和TCA循环等相关功能增强; MARE处理促进了TCA循环相关功能.

图5 土壤细菌群落功能

此外,本文进一步关注了MetaCyc数据库中涉及芳烃降解(Aromatic Compound Degradation, ACD) 相关途径的功能基因绝对丰度.所有样本共检出8个涉及ACD的相关途径,其功能基因绝对丰度之和呈MRE > MARE > MC > CK趋势(图5(D)).其中,对半胱氨酸降解(PWY-5273, p-cumate degradation)和对异丙基甲苯降解(PWY-5266, p-cymene degradation)只在MRE组中检出; MARE处理使得4-羟基苯乙酸酯(3-HYDROXYPHENYLACETATE-DEGRADATION-PWY, 4-hydroxyphenylacetate degradation )和丁香酸酯降解(PWY-6339, syringate degradation)这2个途径相关功能基因绝对丰度显著增加.

3 讨论

本研究21d培养实验结果表明, 3种生物强化处理均显著促进了土壤中PAHs的去除.在接种外源菌群的基础上添加黑麦草根系分泌物或模拟根系分泌物后(即MRE和MARE处理),与单纯接种外源菌群的MC处理相比较,土壤中PAHs残留量更低.微生物降解是生物修复PAHs污染土壤的主要机制[26],向PAHs污染土壤中接种外源菌群进行生物强化已被诸多研究证实是有效的土壤生物修复措施[27-28].生物强化效果的优劣主要取决于接种的外源降解菌群能否成功定殖于污染土壤中,且与土著菌群的竞争是否占据优势.本实验对于接种了外源菌群3周后的土壤样本进行16S rDNA高通量测序后发现,外源降解菌群在细菌群落中仍占据绝对优势地位,在修复期内可充分发挥降解作用加快PAHs的去除进程.外源菌群的竞争优势在添加实际及模拟根系分泌物后依然存在,且两种根系分泌物均进一步加强了土壤中PAHs的生物强化效果. Guo等人也报道了类似的结果,向土壤中添加分枝杆菌-大豆/玉米根系渗出物能够加速PAHs的去除,主要原因为增强了土壤细菌群落的Beta多样性[12].袁静等人向土壤中添加了根系分泌物重要组分亚油酸钠,发现其促进了PAHs的降解,认为这种促进作用与微生物多样性无关,与富集的特定微生物群落相关[29].Corgie等曾报道黑麦草根系分泌物可通过增加降解菌的活性来促进土壤环境中菲的降解[30].为探索生物强化对土壤细菌群落的影响及根系分泌物对生物强化的促进机理,本研究比较了各处理组细菌群落组成、多样性和群落功能.

3种生物强化处理影响了PAHs污染土壤中的细菌群落组成,产生了丰度发生显著变化的差异物种,降低了细菌群落的丰富度、均匀度及多样性,显著改变了细菌群落结构.3种生物强化处理均增加了变形菌门(Proteobacteria)、粘球菌门(Myxococcota)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)和根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)的相对丰度.以上菌门和菌目在CK组中相对丰度均处于前10位,曾在文献中被报道具有PAHs降解功能[31-36].在以上优势物种中,生物强化修复所投加的外源PAHs降解菌群所属门为变形菌门(Proteobacteria),所属目是根瘤菌目(Rhizobiales)和鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales),其余门和目是经生物强化处理后土著菌群中被刺激生长繁殖的细菌.添加实际及模拟根系分泌物后,外源菌群所属菌门的相对丰度增幅比只接种外源菌群的生物强化处理MC小,说明根系分泌物对土著菌群的生长刺激作用较外源菌群更强.LEfSe分析结果显示3种生物强化处理产生了一些被显著富集的物种,且各组间存在共同差异物种,部分共同差异物种属于上述优势菌门和菌目.认为本研究的3种生物强化处理通过向土壤中投加外源降解菌群以及刺激土著降解菌群的生长繁殖,进而促进土壤中PAHs的生物降解. Lu等探讨了葡萄糖、有机酸和丝氨酸等主要根系分泌物组分在芘污染土壤修复中的作用,发现根系分泌物可通过促进脱氢酶活性、改变土壤微生物群落和增加土著PAHs降解菌分枝杆菌的丰度来显著促进芘的生物降解[37].

本文通过PICRUSt2进一步分析了土壤细菌群落功能的变化. 3种生物强化处理均改变了土壤细菌群落的功能结构,分别富集了部分代谢通路,并增加了芳烃降解途径功能基因的绝对丰度.芳烃降解基因丰度增加表明可利用PAHs的细菌增多,这与PAHs降解效果的增强相对应.关于PAHs污染土壤自然衰减的相关研究表明,向土壤中添加根系分泌物能够促进土著PAHs降解菌和降解基因的增加. Liao等研究发现模拟根系分泌物的添加可显著提高土壤中PAHs降解基因(、和基因)的丰度,进而促进土壤中萘、菲和芘的降解[38].有研究报道称PAHs去除程度与PAHs降解基因之间存在着正相关关系[39].本研究结果显示,接种外源降解菌群同时添加根系分泌物也产生了同样的降解促进效果,外源菌与土著菌的竞争未改变根系分泌物对PAHs降解菌的生长刺激作用.添加了根系分泌物的生物强化处理对于细菌群落结构的改变程度较只接种外源降解菌群的MC处理更大,且芳烃降解基因的增加幅度较MC处理更大,修复效果较MC处理更优.这表明添加根系分泌物通过促进PAHs降解菌的生长提升了生物强化修复的效果.

黑麦草实际根系分泌物与模拟根系分泌物对生物强化的显著促进效果相似. MRE和MARE处理后,土壤中PAHs残留量无显著差异.模拟根系分泌物是根据文献所报道的多种实际根系分泌物主体组分(糖类、氨基酸类和小分子酸类)配制得到,在生物强化修复PAHs污染土壤时起到了和黑麦草根系分泌物同样的促进效果.然而,实际根系分泌物组成更为复杂,除上述主体成分外,还含有酶类、甾醇类、酚酸类、脂肪酸、生长因子等组分[40],因而两类根系分泌物对土壤细菌群落的影响存在一些差别. MARE处理对细菌群落结构的改变较MRE处理更大. MRE处理组和MARE组产生的差异物种不同, MRE组的差异物种为AKYG1722科、Diplorickettsiaceae科和Diplorickettsiales目; MARE组的差异物种为芽孢杆菌纲(Bacilli)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)和西索恩氏菌目(Chthoniobacterales).两类根系分泌物对土壤细菌功能影响也存在差别,MRE组和MARE组各自特有功能基因个数分别为272和49. MRE处理使得芳烃降解新增了对半胱氨酸和对异丙基甲苯降解这2个途径, MARE处理组样本未预测出这2个代谢途径,但在共用途径4-羟基苯乙酸酯和丁香酸酯降解中相关功能基因绝对丰度较MRE处理更大.两类根系分泌物处理组间土壤细菌群落的差别未引发二者对PAHs生物强化促进效果的差异.

4 结论

4.1 向PAHs污染土壤中接种由布鲁氏菌(sp.)、苍白杆菌(sp.)、鞘脂单胞菌(sp.)、克雷伯氏菌(sp.)和不动杆菌(sp.)构建的外源高效PAHs降解菌群进行生物强化可加快PAHs的去除, PAHs残留量低于自然衰减对照组15.8%.在以上基础上添加黑麦草根系分泌物或模拟根系分泌物会进一步促进PAHs的生物强化效果, PAHs残留量较对照分别下降了26.3%和24.6%,两种根系分泌物之间差异不显著.

4.2 与自然衰减相比较, 3种生物强化措施均促进了土壤中PAHs降解菌的生长,改变了细菌群落结构,影响了细菌群落的功能,使芳烃降解途径相关功能基因增加,与PAHs降解效果的增强相对应.

4.3 添加黑麦草实际或模拟根系分泌物并接种外源降解菌群后,土壤细菌群落的变化较只接种降解菌群的生物强化处理程度更大,芳烃降解相关功能基因增加得更多.两类根系分泌物分别使土壤细菌群落中产生了各自的差异物种及特有的功能基因,但该差别未引发其对生物强化促进效果的差异.

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Effects of root exudates on bioaugmentation of PAHs-contaminated soil.

LI Yu-ting, BAO Wen-xiu, ZHANG Wen*,WANG Jia-ning, HUANG Yu-jie, SONG Fan-yong

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250103, China)., 2023,43(8)：4183～4193

A soil microcosm experiment was conducted to investigate the effect of bioaugmentation on polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-contaminated soil and the influence of root exudates on bioaugmentation. The content of PAHs residue was decreased by 15.8% with PAHs-degrading bacteria (,,,andsp.) compared to CK in 21d. The addition of ryegrass or artificial root exudates significantly enhanced the bioaugmentation effect and the contents were decreased by 26.3% and 24.6% compared to CK, respectively. These 3bioaugmentation treatments altered the soil bacterial community structures. Compared with the inoculation of PAHs-degrading bacteria alone, the addition of root exudates changed the community structure more significantly and increased the abundance of aromatic compounds degradation-related genes more markedly, indicating that the root exudates affected the bacterial community by promoting the growth of PAHs-degrading bacteria and thus enhanced the bioremediation effect. The different effects of the two types of root exudates on soil bacterial community did not lead to a difference in their contribution to the promotion for bioaugmentation. This study can provide a reference for optimizing bioaugmentation remediation techniques for organic-contaminated soils.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)；soil remediation；ryegrass；root exudates；bioaugmentation

X53

A

1000-6923(2023)08-4183-11

李瑜婷(1998-),女,山东泰安人,硕士研究生,研究方向为有机污染土壤修复及微塑料的环境效应.发表论文1篇.2233605485@qq.com.

李瑜婷,鲍文秀,张 闻,等.根系分泌物对生物强化修复PAHs污染土壤的影响 [J]. 中国环境科学, 2023,43(8):4183-4193.

Li Y T, Bao W X, Zhang W, et al. Effects of root exudates on bioaugmentation of PAHs-contaminated soil [J]. China Environmental Sicence, 2023,43(8):4183-4193.

2023-04-25

国家重点研发计划项目(2019YFC1804103);山东省自然科学基金资助项目(ZR2022MD116)

* 责任作者, 副研究员, zw-sunshine@163.com