中微量元素配施对雪茄烟叶中性致香成分及非挥发性有机酸含量的影响

管庆林 朴晟源 秦艳青 王俊 向欢 张华述 雷云康 赵铭钦

摘要：为给高香气雪茄烟叶生产提供技术参考，本试验以主栽雪茄烟品种德雪l号为材料，以生产上常规施肥为对照（CK），设计6个不同中微量元素配施处理（CK+Mg、CK+S、CK+Mg+S+Zn、CK+Mg+S+Mn、CK+Mg+S+B和CK+Mg+S+Zn+Mn+B），研究其对发酵后雪茄烟叶中性致香成分、非挥发性有机酸含量的影响，并分析发酵后烟叶中性致香成分与非挥发性有机酸含量间的相关性。结果表明，中微量元素配施显著提高发酵后烟叶类胡萝h素降解产物、类西柏烷类降解产物、叶绿素降解产物含量，提高中性致香物质及非挥发有机酸总量。烟叶非挥发性有机酸总量与2-乙酰基吡咯、新植二烯呈显著正相关，与B-大马酮含量呈极显著正相关；与苯甲醇、苯乙醇、5-甲基糠醛和巨豆三烯酮3含量呈显著负相关，与芳樟醇、2，6-壬二烯醛、芳香族氨基酸类代谢产物及其它类香气成分总量呈极显著负相关。处理间综合比较，T2处理（CK+S）发酵后烟叶类胡萝卜素降解产物和螺岩兰草酮、藏花醛、愈创木酚含量最高，其它类香气成分及中性致香成分总量也最高，非挥发性有机酸含量适宜，2-乙酰基呋喃、新植二烯、B-大马酮和其它类香气等致香成分含量积累俱佳。综之，中微量元素合理配施有利于促进发酵后雪茄烟叶中性致香成分积累，改善烟叶非挥发性有机酸类物质含量，提高雪茄烟叶香气可用性。

关键词：中微量元素；雪茄烟；发酵后烟叶；中性致香成分；非挥发性有机酸；相关性

中图分类号：S572.01 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0110-09

雪茄烟作为一种特殊的烟草制品，具有香气量足、吃味浓、劲头大、烟气醇厚且丰富多变等特点，并且其抽吸方式决定雪茄烟对香气的要求更高。香气是评定雪茄烟叶及其制品品质的关键指标，而中性致香物质的组成、含量和平衡比例综合影响着烟叶、烟气香气状况和风格特色。当前，烟叶香气不足是制衡雪茄烟叶原料品质提升的主要因素，而非挥发性有机酸虽然对烟叶烟气和香气没有明显的直接作用，但可以中和碱性香气物质，使吸味醇和，增加烟气浓度，间接影响香气质量。由于雪茄烟叶香气品质除受栽培、晾制技术等因素影响外，发酵工艺也尤为重要，发酵后烟叶刺激性和青杂气降低可使烟叶内含物质更协调，香气和吃味更显露。因此，研究发酵后雪茄烟中性致香物质和非挥发性有机酸含量对改善雪茄烟叶的香气特征具有重要意义。

大中微量元素对烟草非挥发性有机酸及香气物质的积累具有重要作用。有研究表明，氮素是烟碱的重要组成成分，对烟叶香气组成、吸味及刺激性均有重要作用：磷素参与烟叶体内的各种化学过程和生物代谢过程，间接影响烟草的香吃味；施用钾肥能影响烟株体内各种内含物质的积累，显著改善烟叶香吃味，降低焦油含量；过量施硫肥会使烟叶油分较少，香气质与香气量较差，杂气与刺激性较大；适量施Mg2+可增加质体色素含量，提高烟叶品质。陈丽鹃等研究发现，在火山灰土上增施硫酸锌和硼砂能提高烤烟烟叶质体色素降解产物、糠醛、糠醇和苯甲醇等挥发性香气物质的含量。同时，李国明等研究也发现，镁、锰可通过影响叶绿素的合成以及多种酶的活化作用，对三羧酸循环产生影响，进而调控烟草有机酸、高级脂肪酸以及萜类化合物的合成。目前，关于雪茄烟中性致香成分以及非挥发性有机酸与烟叶品质关系的研究主要集中于晾制和发酵措施方面，而从中微量元素配施角度对发酵后雪茄烟叶中性致香成分和非挥发性有机酸含量影响的研究暂未见报道。为此，本试验以当地生产上常规施肥为对照，研究在此施肥水平基础上配施不同种类中微量元素对发酵后烟叶中性致香物质和非挥发性有机酸含量的影响，并对非挥发性有机酸与各香气组分含量间的关系进行分析，旨在为四川优质高香气雪茄烟叶生产提供理论依据和技术途径。

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2021年在四川省什邡市师古镇洛阳村（东经104°04′，北纬31°10′，海拔543 m）进行。试验地土壤为水稻土，有机质含量31.24g／kg、碱解氮120.42 mg/kg、速效磷38.14 mg/kg、速效钾89.14 mg/kg、交换性镁50.54 mg/kg、有效硫23.93mg/kg、有效锌0.63 mg/kg、有效锰3.95 mg/kg、有效硼0.49 mg/kg，pH值6.33。

供试雪茄烟品种为德雪1号。MgO、硫磺粉、硼砂、ZnSO4和MnSO4购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2试验设计

参考前人研究，试验共设7个处理，具体设计见表1。随机区组排列，重复3次。小区面积66.7m2。于2月10日采用漂浮育苗法育苗，于4月20日（六叶一心）移栽。烟株行距120cm，株距40 cm。

按照当地生产方案进行起垄和常规施肥，Mg0、硫磺粉、ZnS04、MnS04、硼砂均于移栽前穴施。每处理按纯N 165 kg/hm2计施，施肥比为N：P2O5；K2O为1：0.8：2。基肥条施，用量为60％的硝酸钾（N：P2O5：K20=13：0：46）、100％的烟草专用复合肥（N：P20S：KZO=10：20：20）和油菜饼肥（N：P205：K20=3.5：2.5：1.5），移栽后35 d再追施40%的硝酸钾。其它田间农事操作与调制管理均按当地优质雪茄烟叶生产技术规范统一进行。

1.3取样方法

各处理均取发酵后中部二级烟叶3 kg，60℃烘干，粉碎过筛，进行中性致香物质和非挥发性有机酸含量测定。

1.4测定项目与方法

1.4.1非挥发性有机酸含量测定 采用《烟草及烟草制品多元酸的气相色谱法》（YC/T 288-2009）测定苹果酸、柠檬酸、丙二酸和草酸等含量。

1.4.2中性致香物质含量测定 采用美国安捷仑7890B-5977E型气一质联用仪测定烟叶中性致香物质含量。样品前处理过程：于1 000 mL圆底烧瓶中加入粉末状烟叶20g、柠檬酸2 g和蒸馏水600 mL，置于同时蒸馏装置一侧，另一侧250mL圆底烧瓶中加入二氯甲烷40 mL和内标（硝基苯）1 mL，同时置于60℃水浴中，打开通水阀，待样品沸腾分层时计时2.5 h，收集有机相。加入无水硫酸钠10 g左右，摇匀澄清后转移至鸡心瓶，并置于60℃水浴中濃缩有机相至1 mL左右即可。

GC/MS分析条件如下。色谱柱：HP-5（60 mX0.25 mm，0.25um）；载气及流速：氦气，0.8 mL/min；进样口温度：250℃；传输线温度：280℃；离子源温度：177℃。升温程序：50℃（2 min）-2℃/min-120℃（5 min）-2℃/min-240℃（30 min）：分流比与进样量：1：15，2ul；电离能：70 eV；质量数范围：50-500 amu；MS谱库：NIST02。

1.5数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016进行数据整理及作表，DPS 7.05软件进行烟叶致香物质与非挥发性有机酸含量间相关性分析（P<0.05）及处理间多重比较（Duncan's）。

2结果与分析

2.1不同中微量元素配施对发酵后雪茄烟叶中性致香成分含量的影响

2.1.1对发酵后雪茄烟叶类胡萝卜素降解产物的影响 类胡萝卜素降解形成的香气物质其香味具有阈值低、刺激性小、香气贡献率大的特点，如B-大马酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯，可增加烟叶的花香和甜香，降低烟气的刺激性。从表2中可以看出，各处理类胡萝卜素降解产物含量均显著高于CK，表现为T2>T3>T5>T4>T1>T6>CK，因此单从类胡萝卜素降解产物方面考虑，T2处理有利于产生香气丰韵的烟叶，其次为T3。从不同降解产物含量分布看，不同处理间差异较大：T3处理B-环柠檬醛、B-大马酮和B-二氢大马酮含量显著高于其它处理：T6处理6-甲基-5-庚烯-2-醇、法尼基丙酮含量最高：T6和T1处理香叶基丙酮含量显著高于其余处理，但两者间差异不显著；对照（CK）6-甲基-5-庚烯- 2-酮含量最高：T2处理巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2、巨豆三烯酮3、巨豆三烯酮4、异佛尔酮、二氢猕猴桃内酯和3-羟基-B-二氢大马酮含量均最高，且各降解产物含量也较为平衡。说明中微量元素合理配施有利于提高类胡萝卜素降解产物含量，而单施硫处理效果则更为显著。

2.1.2对发酵后雪茄烟叶芳香族氨基酸类代谢产物的影响 由表3可知，与CK相比，T3处理可显著提高发酵后烟叶芳香族氨基酸类代谢产物含量，增幅达3.16%。T2处理芳香族氨基酸类代谢产物总量与T1相当，T5、T6和T4处理含量较低且处理间差异显著，并均显著低于CK。4种产物中苯乙醛含量相对较高，尤其是T3处理，其含量占芳香族氨基酸类香气代谢产物总量的54.89%，这对增加烟叶果香香气有重要作用。

2.1.3对发酵后雪茄烟叶棕色化反应产物含量的影响 棕色化反应产物与烟草坚果香、甜香和可可香等香味的形成密切相关，是烟叶香味的重要来源。由表4可以看出，所测6种棕色化反应产物中，各处理均以糠醛含量最高，平均占总量的54.84%。不同处理间棕色化反应产物含量有明显差异，除T4外，各处理其总量较CK均显著增加，T1、12、T3、T5、T6处理较CK分别增加8.98％、9.53%、18.58%、10.15％和11.73％。T3处理糠醇、5-甲基糠醛含量显著高于其余处理，且处理间差异显著：T6处理糠醛、2-乙酰基吡咯和3，4-=甲基-2，5-呋喃二酮含量最高：T2处理2-乙酰基呋喃含量最高，处理间差异多达显著水平。说明T3和T6处理对提高发酵后烟叶棕色化反应产物有显著的促进作用。

2.1.4对发酵后雪茄烟叶类西柏烷类及叶绿素降解产物含量的影响 新植二烯是烟草中性致香物质中含量最高的成分，与其降解产物西柏一三烯二醇都是烟叶重要的香味成分，本身具有很好的香气，可提高烟叶香气和吃味。而且其在烟叶燃烧过程中可作为载体捕集烟气气溶胶内的香气物质并将之带人烟气中，是烟叶重要的增香剂。类西柏烷类降解产物茄酮及其转化产物（茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等）均是烟草重要的香味物质，其特有的杂双环结构使其具有特殊的香味，对改善烟草的香吃味具有重要意义。由表5可知，各处理烟叶茄酮含量均显著高于CK，以T6最高，其次为T3，分别为37.66、35.71ug／g。不同處理烟叶新植二烯含量较CK均显著增加，表现为T5>T2>T1>T3>T4>T6>CK，分别较CK增加44.55％、41.95%、37.29%、35.51%、33.26％和30.24％。不同处理间致香物质总量（除去新植二烯）以T3处理最高，为214.22 ug/g，其它依次为T2、T6、T5、Tl、T4处理，均显著高于CK。该类中性致香物质总量范围为701.25-961.83 ug/g，除T4和T6处理间无显著差异外，其余各处理间差异均达到显著水平，且均显著高于CK。茄酮占该类中性致香物质总量（除新植二烯）比率的范围为0.1121-0.1933，T6处理最高，T3次之，为16.67%，各处理间差异显著：而新植二烯占该类中性致香物质总量的比率以T4和T5处理最高，且二者间无显著差异。

2.1.5对发酵后雪茄烟叶其它类香气成分含量的影响 由表6可以看出，烟叶其它类香气成分中，不同处理间螺岩兰草酮、藏花醛、愈创木酚、2，6-壬二烯醛含量及其总量均以T2处理最高，均显著高于CK;CK芳樟醇含量显著高于其它各处理，为1.38 ug/g。

2.2不同中微量元素配施对发酵后雪茄烟叶非挥发性有机酸含量的影响

烟叶非挥发性有机酸具有调节烟气酸碱性、中和游离碱、醇和吸味、平衡烟气的作用。苹果酸、柠檬酸和草酸等非挥发酸可与生物碱结合成盐，调节烟气质子化和游离态烟碱比例，调节烟草的酸碱度，增加烟气浓度，平衡烟气；硬脂酸、棕榈酸等在烟草中的含量较高，具有弱的脂蜡香，能使烟气醇和，且有蜡味：而油酸等不饱和脂肪酸则会增加烟气刺激性，产生涩味。由表7可以看出，相比CK，中微量元素配施处理大多不同程度地提高烟叶6种非挥发性有机酸含量，处理间差异显著，但非挥发性有机酸组成和含量处理间存在明显差异。草酸、富马酸和苹果酸含量以T6最高，且处理间差异显著：T4和Tl处理丙二酸含量显著高于其它处理：T1和T3处理丁二酸含量显著高于其它处理：柠檬酸含量以CK最高，T6处理最低，分别为97.40、64.73 mg／g；十六酸含量除CK外，其它各处理均未检测到：油酸含量以CK最高，显著高于各中微量元素配施处理。以上说明中微量元素配施有利于提高苹果酸、草酸等非挥发性酸含量，降低油酸等不饱和脂肪酸含量，醇和烟气，降低刺激性，消除涩味。

2.3不同处理下发酵后雪茄烟叶中性致香物质与非挥发性有机酸总量间的相关性分析

由于测定的香气物质较多，在此仅列出与非挥发性有机酸总量相关性达到显著水平的致香物质。由表8可以看出，非挥发性有机酸与2-乙酰基吡咯、新植二烯含量呈显著正相关，与B-大马酮含量呈极显著正相关，由此推断配施中微量元素提高发酵后烟叶非挥发性有机酸含量的同时，也可提高烟叶新植二烯、2-乙酰基吡咯和B-大马酮的含量。而非挥发性有机酸含量与苯甲醇、苯乙醇、5-甲基糠醛和巨豆三烯酮3含量呈显著负相关，与芳樟醇、2，6-壬二烯醛、芳香族氨基酸代谢产物和其它类香气成分总量呈极显著负相关，表明烟叶中非挥发性有机酸含量的提高会抑制苯甲醇、苯乙醇、5-甲基糠醛、巨豆三烯酮3、芳樟醇、2，6-壬二烯醛、芳香族氨基酸代谢产物和其它类香气成分的形成。

3讨论

3.1中微量元素配施对发酵后雪茄烟叶中性致香成分含量的影响

烟田平衡施用中微量元素可明显改善烟叶中性致香物质含量。叶协锋等研究发现，氮磷钾合理配施有利于烤烟类胡萝卜素降解产物含量的积累以及烟叶香气质和香气量的提高，而刘国顺等研究也发现，施用中微量元素肥料可明显提高类胡萝卜素降解产物含量和中性致香物质总量。本研究表明，中微量元素配施均可显著增加类胡萝卜素降解产物含量，T2处理（配施硫磺粉）效果最好：各配施处理类胡萝卜素降解产物中各组分含量除6-甲基-5-庚烯-2-酮外，其余各组分含量大多高于CK。这可能是由于中微量元素配施下烟株生长关键时期能够保证矿质元素营养充足供应，促进烟株生长发育和叶绿素合成，进而有利于烟叶香气物质的形成。其中，硫素营养可增大烟草前期的叶面积和叶绿素合成，促进类胡萝卜素（质体色素）降解，利于烟叶香气总量的提高。

韦凤杰、齐永杰等研究发现，硼、锌处理促进叶片芳香族氨基酸类香气物质的形成，利于烟叶香气总量的提高。而孙立娟等的研究则显示，施用锰、硼元素减少芳香族氨基酸类香气物质总量，不利于香气形成。本研究中，配施中微量元素除T3处理（镁、硫和锌配施）芳香族氨基酸类香气成分总量高于对照外，其余各处理均低于对照。镁、硫、硼元素配施处理芳香族氨基酸类香气总量及苯甲醛等香气组分含量均低于对照，这与孙立娟等的研究结果吻合。这可能是因为四川什邡当地气候湿润多雨，植烟土壤中有效硼淋失较多、含量较低，烟株存在不同程度的缺硼症状，导致蛋白质代谢和生物碱合成受阻，从而不利于芳香族氨基酸类物质积累。

棕色化反应产物是氨基和羰基化合物在一定条件下发生分子重排形成的类黑素，其香气受反应物的种类、温度等条件的影响较大。本试验结果显示，除T4外，各处理棕色化反应产物含量较CK均有所增加，以T3处理含量最高。表明配施锰元素减少叶片棕色化反应产物的形成，抑制雪茄烟叶香气总量的提高，这与聂新柏等的研究结果相反。这可能是由于四川地区的弱酸性土壤和淹水灌溉方式，使得土壤有效锰含量偏高，高锰胁迫下植物叶片输导组织坏死，蛋白质合成受阻，氨基酸类化合物含量较低，导致棕色化反应进程受阻。施锌促进叶片棕色化反应产物的形成，提高烟叶香气含量。这是因为锌是多种酶的组成成分和活化剂，参与烟株的光合作用、氮素代谢进程，促进蛋白质的合成和糖类物质的转化，丰富棕色化反应物的种类，进而促进叶片棕色化反应产物的形成。

本研究还发现，配施中微量元素各处理烟叶茄酮、新植二烯含量均高于CK，其中茄酮含量以T6最高，新植二烯含量以T5处理最高。这可能与T6处理含有烟草正常生长发育所需的各种营养元素有关，均衡的养分促进细胞发育、生理代谢以及物质能量转化，从而提高烟草萜烯类化合物和茄酮含量的积累。而硼元素参与叶绿素的合成，施硼可提高烟草叶绿素含量，进而在叶绿素酶的作用下生成新植二烯和呋喃等化合物，促进新植二烯香气物质的形成。

不同处理间烟叶螺岩兰草酮、藏花醛、愈创木酚、2，6-壬二烯醛含量和其它类香气总量均以施硫处理（T2）最高，表明施硫可以促进烟叶香气物质的形成．改善香气质量，这与张晓海等的研究结果一致。原因可能是：土壤硫的供应水平决定着叶肉细胞内叶绿体蛋白上的有机硫含量，影响叶绿体的形成及其功能的正常发挥，而施硫可显著提高叶绿素a和叶绿素b含量，且叶绿素是香气前体物质：同时，硫是蛋氨酸和半胱氨酸组成的必需元素，施用硫肥提高一些必需氨基酸尤其是蛋氨酸含量，为烟叶棕色化反应提供反应物。

3.2中微量元素配施对发酵后雪茄烟叶非挥发性有机酸含量的影响

中性致香物质、非挥发性有机酸的组成和含量与烟叶香味品质有密切关系。本研究结果表明，配施中微量元素提高发酵后烟叶的非挥发性有机酸含量，降低柠檬酸、十六酸和油酸的含量，这与叶协锋、张豹林等的研究结果相吻合。各配施处理中非挥发性有机酸总量以T4处理（配施Mg0、硫磺粉和MnSO4）最高，这可能是锰元素通过影响叶绿素合成以及多种酶的活化作用对三羧酸循环产生作用，进而促进烟草有机酸及高级脂肪酸含量的积累。

3.3中微量元素配施下发酵后雪茄烟叶中性致香物质与非挥发性有机酸总量间的相关性分析

烟叶非挥发性有机酸与中性致香物质含量间的相关性比较密切。其中，非挥发性有机酸与2-乙酰基吡咯、新植二烯、B-大马酮含量呈显著或极显著正相关，而与苯甲醇、苯乙醇、5-甲基糠醛、巨豆三烯酮3、芳樟醇、2，6-壬二烯醛、芳香族氨基酸類代谢产物和其它类香气成分总量呈显著或极显著负相关。说明非挥发性有机酸在烟草中可通过参与碳水化合物、含氮化合物的合成以及酶或非酶的作用，活化催化香味物质形成的原料，进而影响致香物质的形成，但其具体的分子机制尚需进一步研究。

4结论

在当地常规施肥基础上配施中微量元素显著提高发酵后烟叶类胡萝h素降解产物、类西柏烷类产物、叶绿素降解产物含量，提高中性致香物质及非挥发性有机酸总量，改善烟叶香气质量。烟叶非挥发性有机酸与致香物质间的相关性分析表明，非挥发性有机酸与2-乙酰基吡咯、新植二烯、B-大马酮含量呈显著或极显著正相关，与苯甲醇、苯乙醇、5-甲基糠醛、巨豆三烯酮3、芳樟醇、2，6-壬二烯醛及芳香族氨基酸类代谢产物、其它类香气成分总量呈显著或极显著负相关。处理间比较，T2处理（CK+S）发酵后烟叶类胡萝卜素降解产物和螺岩兰草酮、藏花醛、愈创木酚含量最高，其它类香气物质及中性致香物质总量也最高，非挥发性有机酸含量适宜，2-乙酰基呋喃、新植二烯、B-大马酮以及其它类香气等成分含量积累俱佳，利于高香气雪茄烟叶的形成。本研究得出的中微量元素配施下发酵后雪茄烟叶中性致香物质和非挥发性有机酸含量的积累规律，可为四川高香气雪茄烟叶开发提供理论参考。