施氮水平对花生根际土壤微生物群落结构和多样性的影响

梁满 孟维伟 陈志德 沈一 刘永惠 沈悦 刘柱 南镇武 徐杰 张正

摘要：本试验通过16S rRNA基因测序技术，研究零氮（0 kg/hm2）、低氮（75 kg/hm2）、中氮（150 kg/hm2）和高氮（225 kg/hm2）4个氮肥梯度对花生根际土壤微生物群落组成和结构的影响。结果表明，施氮可以提高花生根际土壤微生物群落的丰富度和多样性，不同氮肥处理中以中氮处理的Chao 1指数和Shannon指数最高。施氮处理下的OTUs个数均多于不施氨，且随着氮肥施人量的增加呈先升高后降低的趋势，中氮处理较零氮、低氮和高氨分别高11.21%、4.90%和7.01%。不施氮和在一定施氮范围内，土壤微生物群落稳定，但是高氮会导致土壤微生物群落不稳定。16S rRNA功能预测分析显示，施氮处理下的细胞运动等功能基因的丰度相对升高，对花生根际土壤微生物群落的功能丰度谱产生一定的影响。本研究明确了施氮对花生根际土壤微生物群落结构和多样性的影响，为深入研究不同施肥措施对花生根际微生态的影响提供了借鉴。

关键词：花生根际；施氨水平；土壤微生物群落功能多样性；16S rRNA

中图分类号：S565.2：S154.34 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0078-06

花生是我国重要的油料作物，也是重要的植物油脂和蛋白质来源。氮是花生吸收量最大的营养元素，增施氮肥能提高花生产量、改善花生品质。此外，地下部微生物群落也受到氮肥的影响。土壤氮水平是影响根际微生物的重要因素，对土壤微生物群落结构和多样性有一定的影响。研究发现，氮肥的施用可以提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落的丰富度和功能多样性。付智丹等发现适宜的施氮量不仅能够增加玉米、大豆套作土壤中的真菌、放线菌和固氮菌的数量，还能调节土壤氮素的转化。赵帆等发现微生物群落结构受多种土壤环境因子的影响，以土壤全氮含量和pH值对微生物群落的影响最显著。丁红等发现在于旱低氮双重胁迫下，花生根际细菌可能在花生生长和响应逆境胁迫中起重要作用。然而，目前关于氮肥用量和微生物类群之间的关系仍未明确，不同施氮量对花生土壤微生物群落的影响还缺乏系统研究。

本试验探究不同施氮水平对花生根际土壤微生物群落组成和结构的影响，预测细菌群落功能，以期为花生建立合理的施肥制度和提高氮肥利用率提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验地概况与试验材料

试验于2018年在山东省农业科学院济阳试验基地进行，土壤类型为潮土，质地沙壤，0-20cm土层有机质含量为12.3g/kg，全氮0.5 g/kg，碱解氮52.8 mg/kg，速效磷93.1 mg／kg，速效钾10.2 mg/kg，盐分0.21％，pH 7.3。

供试花生品种为花育25号，垄作种植，垄底宽80 cm，垄面宽40 cm，垄上播2行花生，行距35cm，穴距18 cm，每穴2株。

1.2试验设计

试验设4个处理：NO（零氮，0 kg/hm2）、Nl（低氮，75 kg/hm2）、N2（中氮，150 kg/hm2）、N3（高氮，225 kg/hm2）。3次重复。磷肥为P2O5120 kg/hm2、钾肥为K2O 120 kg/hm2，均作底肥一次性施入。

1.3根际土壤采集

于花生结荚期将整株挖出，抖落根系表层土壤，用灭菌刷子将根际1～10 mm的土壤拂刷下来放入无菌袋中，同一处理的花生根际土壤样品混合成一个土壤样品，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存。相关测试由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.4测定方法

根据OMEGA Soil DNA Kit试剂盒（USA）说明书进行土壤微生物总DNA的提取，用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，NanoDrop ND-2000核酸蛋白测定仪分析检测DNA的浓度和纯度。以提取的土壤样本DNA为模板，对土壤细菌16SrRNA基因进行扩增，引物为V3-V4区的343F（5-TACGGRAGGCAGCAG -3'）以及798R（5-AGGGTAT CTAATCCT-3'）。PCR扩增体系（20uL）：预混液10 uL，正、反向引物（10 umol/L）各0.8 uL，DNA模板（10 ng）1 uL，ddH2O补足至20uL。扩增程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 60 s，共30个循环：72℃ 10 min。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，采用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，UnionCity，USA）进行纯化，利用QuantiFluorTM -ST（Promega，USA）进行定量和Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序。

1.5生物信息学分析

采用Alpha多样性分析方法，对样本间的主成分进行分析（PCA），以挖掘花生根际土壤细菌群落组成的差异。基于Greengenes数据库注释的16S rRNA测序数据，使用PICRUSt软件预测已知微生物基因功能的构成，从而统计不同样本和分组之间在功能上的差异。

2结果与分析

2.1土壤微生物群落丰富度和多样性变化

由表1可以看出，各处理间覆盖度无显著差异，平均值均在0.95以上，土壤样本文库覆盖率较高。施氮处理下的Observed species指数和Chao 1指数均高于不施氮处理，且均随氮肥施入量的增加呈先升高后降低的趋势，其中N1和N2的Observed species指数差異不显著，但显著高于NO和N3，Chao 1指数以N2处理最高。Shannon指数随着施氮量的增加先增加后减少，在N2处理达到最大值；施氮处理下的Simpson指数差异不显著，但均低于不施氮处理，说明施氮处理群落物种分配不均匀，多样性高。表明施氮可以提高花生根际微生物群落的丰富度和多样性，不同施氮水平以N2处理最优。

2.2土壤微生物群落组成分析

图1可见，在门分类水平上，各处理中根际土壤细菌群落排名前5位的优势菌门均为变形菌门（Proteobacteria，41.41％～47.50％）、放线菌门（Actinobacteria，15.76％-16.80％）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，12.34％～15.04％）、拟杆菌门（Bacteroidetes，11.81％-15.38％）和厚壁菌门（Firmicutes，4.87％-5.18％）。在优势菌门中，施氮处理下的变形菌门和放线菌门的相对丰度均高于不施氮处理，其中變形菌门相对丰度以N2处理最高，放线菌门的相对丰度在N1和N2处理下差异不显著，但均高于N3处理，说明花生根际土壤微生物群落的优势菌门相对丰度并没有随着施氮量的增加而一直增多。施氮量对其它3种优势菌群（芽单胞菌门、拟杆菌门和厚壁菌门）的相对丰度影响不大。

2.3土壤微生物群落OTUs聚类分析

如图2所示，所有处理中共有的OTUs为1 385。在97％的相似度下，NO、N1、N2、N3各处理分别平均获得2 445、2 592、2 719、2 541个OTUs，3种施氮处理下的OTUs数均多于不施氮，且随着氮肥施人量的增加呈先升高后降低的趋势．其中N2处理较NO、N1和N3高11.21％、4.90％和7.01％。表明，施氮可以提高花生根际微生物群落的OTUs数。

2.4土壤微生物群落主成分分析

如图3所示，横坐标（PCl）能够解释12.6％的样本差异，纵坐标（PC2）能够解释11.4％的样本差异。聚类分析表明，同一处理3次重复聚集到同一分支，不同处理样本间距离较远，差异较大，聚集于不同分支。PC1将NO和N1与N2和N3明显区分，NO处理全部分布在PC1的负方向，N2和N3处理分布在PC1的正方向，而N1处理在PC1正负方向上均有分布。PC2将N3处理与NO、N1和N2明显区分，N3处理全部分布在PC2的负端，NO、N1和N2处理主要出现在PC2的正端。说明施氮影响了花生根际土壤环境，使根际土壤细菌群落多样性产生较大差异。从图3还可以看出，NO、N1和N2处理得分系数离散小，N3处理得分系数变异较大，这一研究结果表明，不施氮和在一定施氮范围内，土壤微生物群落稳定，但是过量施入氮肥会导致土壤微生物群落不稳定。

2.5土壤微生物群落潜在功能预测

如图4所示，氨基酸转运和代谢（amino acid transport and metabolism）、转录（transcription）、信号传导（signal transduction mechanisms）、细胞壁／膜／包膜生物发育（cell wall/membrane/envelope biogenesis）、能量生产与转化（energy production and conversion）和碳水化合物转运和代谢（carbo-hydrate transpon and metabolism）这6类功能所占的比重较大。与不施氮相比，施氮处理下的细胞运动（cell motility）、细胞骨架（cytoskeleton）和细胞内运输、分泌和囊泡运输（intracellular trafficking，secretion，and vesicular transport）等功能基因的丰度相对升高，说明花生根际土壤细菌群落在适量氮素的调控下会产生较高的活性。

3讨论

根际是植物根系与土壤微生物之间相互作用所形成的微生态环境，在植物生长和发育过程中起着重要作用，根际微生物作为根际的重要组成部分，其群落多样性反映群落总体的动态变化。科学的肥料管理通过影响土壤微生物量和菌群结构，从而在一定程度上改变土壤养分和作物产量。本研究显示，施氮可以提高花生根际微生物群落的丰富度和多样性，其中150kg/hm2氮肥施用量的Chao 1指数和Shannon指数最高。聂江文等研究湖南双季稻区微生物群落发现，在冬种紫云英不还田条件下配施氮肥处理的多样性指数以及物种丰富度指数均高于不施氮。谢文军、覃潇敏等发现，施用无机化肥可以提高土壤微生物的Shannon指数。说明土壤氮水平对土壤微生物的多样性和群落结构有一定的影响，本研究发现中氮处理下的土壤微生物活性最佳，高氮处理对微生物的活性产生抑制作用。

秸秆还田及配施氮肥条件下，水稻田根际土壤中优势菌门为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门等，干旱胁迫和低氮处理下花生根际土壤中的变形菌门相对丰度降低。本研究中，各根际土壤细菌群落的处理中排名前5位的优势菌门分属变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，其中，变形菌门相对丰度以中氮处理最高，说明变形菌门在低氮条件下的相对丰度较低，这与丁红等的研究结果一致。施肥对土壤微生物群落的影响存在一定的不确定性，白震等发现不同配施会抑制黑土中大多数菌群的生长，但在氮肥优化条件下，能提高微生物的菌群含量。本研究发现，施氮影响了花生根际土壤环境，使根际土壤细菌群落多样性产生较大差异，过量施人氮肥会导致土壤微生物群落不稳定，可能是在含氮较高的土壤中，花生结瘤固氮量少，固氮细菌群落的生长受到抑制。16S rRNA功能预测表明施氮对花生根际土壤微生物群落的功能丰度谱产生一定的影响，施氮处理下的细胞运动等功能基因的丰度相对升高，可能与土壤环境的变化导致花生根际土壤细菌代谢发生改变有关。氮肥对土壤中微生物的影响也与土壤的环境因素和作物管理等条件有关，施氨水平对花生根际微生物群落结构和多样性的影响还需要进一步深入研究和验证。因此，今后还应深入研究不同施肥措施对花生根际微生态的影响，探讨根系发育与土壤微生物群落结构和多样性的关系，以期为花生建立合理的施肥制度和提高氮肥利用率提供理论支撑。

4结论

与不施氮相比，施氮可以提高花生根际微生物群落的丰富度和多样性，以中量氮肥的Chao 1指数和Shannon指数最高。花生根际土壤细菌群落以变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门和厚壁菌门等优势菌门为主，施氮处理提高了变形菌门和放线菌门的相对丰度，但其丰度并没有随着施氮量的增加而一直增多。施氮处理下的OTUs数均多于不施氮，中氮处理下的OTUs数最多，且随着氮肥施入量的增加呈先升高后降低的趋势。不施氮和在低、中量氮肥施用范围内，土壤微生物群落稳定，过量施入氮肥会导致土壤微生物群落不稳定。