西洋参总皂苷及总多糖调节NK细胞和T细胞的作用研究*

韩红玉,桑 锋,段晓颖

(河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000)

西洋参为五加科植物西洋参(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根,性寒,味苦、微甘,归心、肺、肾经,具有补气养阴、清热生津的功效,临床常用于治疗气虚阴亏、虚热烦倦、咳喘痰血、内热消渴、口燥咽干等[1]。现代研究表明,西洋参具有提高免疫力、降低血糖、抗疲劳及抗衰老等多种药理作用[2-3],为临床常用的药食同源之品。西洋参化学成分复杂,含有皂苷类、多糖类、挥发油、微量元素及氨基酸等多种活性成分[4],以总皂苷和总多糖为主要活性成分。近年来,关于西洋参提取物及与其他中药配伍应用对免疫调节作用的研究引起了学者的广泛关注并取得一定进展,但是关于西洋参有效组分对不同免疫细胞的具体作用却鲜有报道。免疫系统主要由固有免疫和获得性免疫构成,自然杀伤细胞(NK细胞)是固有免疫的主要组成部分,T淋巴细胞(T细胞)是获得性免疫的主要组成部分。本课题研究了西洋参总皂苷和总多糖对NK细胞、T细胞的体外增殖、凋亡作用的影响,揭示西洋参有效组分对机体免疫系统的调节作用,为西洋参的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

NK细胞株:NK-92MI细胞株,由河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室提供。T细胞株:Jurkat细胞株,购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 药品、试剂与仪器

西洋参,来自河南中医药大学第一附属医院中药房,产地美国,批号20140217-1。胎牛血清(FBS),美国海克隆公司产品;RPMI-1640培养基,北京索莱宝有限公司产品。TU-1800PC型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司产品;CKX41-A32PH型倒置荧光相差显微镜,日本奥林巴斯株式会社产品;80-2型台式低速离心机,上海手术器械厂产品;3111型CO2培养箱,美国赛默飞世尔科技公司产品;680酶标仪,美国伯乐公司产品;TMQ-C/3870型全自动台式灭菌器,山东新华医疗器械股份有限公司产品;FACSCalibur流式细胞仪,美国碧迪公司产品。

1.3 西洋参总皂苷与总多糖的制备

按照参考文献[5]制备西洋参总皂苷与总多糖。称取西洋参,加入乙醇提取2次,合并2次提取液,滤过,浓缩备用;选用D101树脂,上样,水洗,洗脱剂洗脱,合并洗脱液,经减压干燥得西洋参总皂苷粉。称取西洋参,加水提取3次,合并提取液,滤过,浓缩备用;选用HPD600树脂,上样,洗脱剂洗脱,合并洗脱液,经减压干燥得西洋参总多糖粉。

1.4 西洋参总皂苷与总多糖的含量测定

精密称取西洋参皂苷粉0.485 1 g,加水定容至25 mL,摇匀,精密吸取10 mL,用等量的乙醚和正丁醇依次萃取2次和3次,合并正丁醇液蒸干,加甲醇溶解,水浴蒸干、冷却,分别加入新配制的5 mL/L香草醛冰乙酸溶液和高氯酸,置60 ℃水浴中加热15 min,冰浴冷却,加入冰乙酸,在548 nm处测定吸收度,计算西洋参总皂苷的含量。精密称取西洋参多糖粉14.223 mg,加水定容至100 mL,摇匀后精密吸取1 mL,加入蒽酮硫酸溶液,混匀后置95 ℃水浴中加热15 min,冰浴冷却,在627 nm处测定吸收度,计算西洋参总多糖的含量。

1.5 对NK-92MI细胞、Jurkat细胞体外增殖的影响

根据新修订的第五代国家标准《中国地震动参数区划图》(GB18306-2015)[7]，云南全省国土面积84%位于地震烈度VII度以上，是全国平均水平的两倍。随着经济建设不断向山区、河谷等地震高风险区发展以及人口增加、城镇化进程的加速、经济发展GDP的快速增长等因素，暴露于地震灾害高风险区的生命财产总量增加，20世纪80年代以后，特别是21世纪以来，云南地震灾害损失急剧加大。2014年鲁甸地震与景谷地震造成了逾270亿元的直接经济损失，占全省GDP总量的近3%，其中，鲁甸MS6.5级地震直接经济损失近200亿元，是1996年丽江MS7.0级地震损失的近50倍。

实验测得西洋参总皂苷的含量为59.87%,西洋参总多糖的含量为50.70%。

1.6 对NK-92MI细胞、Jurkat细胞体外凋亡的影响

当西洋参总皂苷的质量分数在9～145 mg/L时,各个时间点的OD值均显著大于空白对照组,表明西洋参总皂苷可以促进Jurkat细胞的体外增殖,该促进作用与西洋参总皂苷的质量分数直接相关,73 mg/L、24 h时作用较佳。见表3。当西洋参总多糖的质量分数在40～1 202 mg/L时,各个时间点的OD值均显著高于空白对照组,表明在一定质量分数范围内,西洋参总多糖可以促进Jurkat细胞的体外增殖,该促进作用与西洋参总多糖的质量分数直接相关,601 mg/L、12 h时作用较佳。当西洋参总多糖质量分数为4 mg/L时,其OD值与空白对照组对比,差异无统计学意义,表明此质量分数下的西洋参总多糖对Jurkat细胞的增殖没有明显作用。见表4。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 西洋参总皂苷及总多糖的含量

常州有“三吴重镇”“八邑名都”之称，被乾隆帝誉为“泰伯高风”之所在。常州景观一级目录和二级目录的数量分别为3、13项，吸引康、乾二帝反复游览的景观主要位于今无锡境内，如惠山、惠山泉等。

将NK-92MI细胞和Jurkat细胞分别以5×105和4×105接种在96孔板,置于37 ℃、5 mL/L CO2培养箱中培养24 h,以半径15 cm、转速1 700 r/min离心,弃培养基,加不同质量分数的西洋参总皂苷(9、18、36、73、145 mg/L)和总多糖(4、16、40、80、160、321、601、1 202 mg/L ),每个质量分数设6个复孔,继续培养6、12、24、48和72 h,镜下观察细胞数量变化。同时设置空白对照组(仅有细胞,不加药)。每孔加MTT 20 μL,孵育4 h,离心弃上清,加DMSO 150 μL,以酶标仪490 nm测OD值,计算细胞增殖率(%)。细胞增殖率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%

2.2 对NK-92MI细胞体外增殖的影响

2012年，妈妈退休了，巧玉也大学毕业工作了。于是，妈妈又带着外婆来北京，她们和巧玉一起租住在我住处附近。她来北京，居然是想来给我做饭。妈妈在北京的日子和在重庆没什么不同，每天陪外婆，隔几天带外婆入院（外婆患有鼻咽癌等疾病）。没有半点埋怨，每天乐呵呵地推着外婆出出进进。一旦结余下一些钱，连同她的稿费，她就盘算着给巧玉准备嫁妆。

表1 西洋参总皂苷对NK-92MI细胞增殖率的影响 n=6,%

表2 西洋参总多糖对NK-92MI细胞增殖率的影响 n=6,%

2.3 对Jurkat细胞体外增殖的影响

将NK-92MI细胞和Jurkat细胞均以7.5×105接种在48孔培养板内,置于37 ℃、55 mL /L CO2培养箱中培养24 h,以半径15 cm、转速1 700 r/min离心,弃培养基,加不同质量分数的西洋参总皂苷(9、18、36、73、145 mg/L )和总多糖(4、16、40、80、160、321、601、1 202 mg/L),继续培养12、24和48 h。同时设置空白对照组(仅有细胞,不加药)。在室温下,以半径15 cm、转速1 000 r/min离心7 min,收集细胞,用预冷1×PBS缓冲液 (4 ℃) 重悬细胞,洗涤细胞两次。用250 μL稀释过的结合缓冲液(去离子水按1∶4)重新悬浮细胞,调节细胞密度为1.0×106/mL。取100 μL于5 mL流式管中,并分别加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI溶液。混匀后于室温避光孵育15 min,向流式管中再加入300 μL PBS缓冲液,混匀后用流式细胞仪检测凋亡情况。实验平行检测3次,取平均值,计算凋亡抑制率(%)。凋亡抑制率=(对照组凋亡率-实验组凋亡率)/对照组凋亡率×100%

当西洋参总皂苷的质量分数在9～387 mg/L时,Jurkat细胞凋亡率均显著小于空白对照组,表明在一定质量分数范围内,西洋参总皂苷可以抑制Jurkat细胞体外凋亡,73 mg/L、24 h时作用较佳。见表7。西洋参总多糖的质量分数在16～601 mg/L时,Jurkat细胞凋亡率均显著小于空白对照组,表明在一定质量分数范围内,西洋参总多糖可以抑制Jurkat细胞体外凋亡,且作用与西洋参总多糖的质量分数直接相关,601 mg/L、12 h时作用较佳。见表8。

当西洋参总皂苷的质量分数在36～145 mg/L时,各个时间点OD值多显著大于空白对照组,增殖率均为正值,表明在一定质量分数范围内,西洋参总皂苷可以促进NK-92MI细胞的增殖,且作用与西洋参总皂苷的质量分数直接相关,145 mg/L、24 h时作用较佳。当西洋参总皂苷质量分数在9、18 mg/L时,其OD值与空白对照组对比,差异无统计学意义,表明此质量分数下的西洋参总皂苷对NK-92MI细胞的增殖没有明显作用。见表1。当西洋参总多糖的质量分数在40～1 202 mg/L时,各个时间点的OD值均显著大于空白对照组,表明在一定质量分数范围内,西洋参总多糖可以促进NK-92MI细胞的增殖,且作用与西洋参总多糖的质量分数直接相关,1 202 mg/L、12 h时作用较佳。当西洋参总多糖质量分数为4、16 mg/L时,其OD值与空白对照组对比,差异无统计学意义,表明此质量分数下的西洋参总多糖对NK-92MI细胞的增殖没有明显作用。见表2。

表3 西洋参总皂苷对Jurkat细胞增殖率的影响 n=6,%

表4 西洋参总多糖对Jurkat细胞增殖率的影响 n=6,%

2.4 对NK-92MI细胞体外凋亡的影响

当西洋参总皂苷的质量分数在145、387 mg/L时,NK-92MI细胞的凋亡率均显著小于空白对照组,表明在一定质量分数范围内,西洋参总皂苷可以抑制NK-92MI细胞体外凋亡,在387 mg/L、24 h时对NK-92MI细胞的凋亡抑制作用较佳;质量分数为36 mg/L时,其凋亡率与空白对照组对比,差异无统计学意义,表明此质量分数下的西洋参总皂苷对NK-92MI细胞的凋亡没有明显作用。见表5。当西洋参总多糖的质量分数在40～1 202 mg/L时,NK-92MI细胞凋亡率均显著小于空白对照组,表明在一定质量分数范围内,西洋参总多糖可以抑制NK-92MI细胞体外凋亡,1 202 mg/L 、24 h时作用较佳。见表6。

表5 西洋参总皂苷对NK-92MI细胞凋亡抑制率的影响 n=3,%

表6 西洋参总多糖对NK-92MI细胞凋亡抑制率的影响 n=3,%

2.5 对Jurkat细胞体外凋亡的影响

每一种鹿都有独特的自然生长历史。在野外花时间去和鹿相处，了解它们的习性，能帮助你了解拍摄主体，预测它们的行为。

表7 西洋参总皂苷对Jurkat细胞凋亡抑制率的影响 n=3,%

表8 西洋参总多糖对Jurkat细胞凋亡抑制率的影响 n=3,%

3 讨 论

NK细胞能够分泌颗粒酶、穿孔素、细胞因子等杀伤靶细胞,不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关,还在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。T细胞分泌各种介质并作用于其他淋巴细胞或巨噬细胞,行使信息的传递、识别、效应等功能,是机体免疫反应的重要调节细胞[6]。本研究选择NK细胞株NK-92MI细胞、T 细胞株Jurkat细胞作为实验细胞,研究西洋参总皂苷和总多糖对其体外增殖和凋亡作用的影响,探讨西洋参对免疫细胞功能的调节作用。

大数据时代到来，使信息变化速度不断加快，信息量日益扩充，对商业银行工作提出了更高的要求。随着国际金融监管体系日益健全，加强审计监督，建立以风险为导向的现代化审计管理体系，不断完善审计内容，健全审计指标体系，加强责任落实，重点审核金融机构在财务收支、内部控制、风险纰漏以及问责机制等方面的贯彻落实情况，是当前商业银行审计工作的重点。国家审计资源本身有限，对商业银行等金融机构不能开展连续性审计，加上对其内部经营实际情况不能全面了解，从而不利于审计职能的有效发挥。

本研究结果显示,在一定质量分数范围内,西洋参总皂苷和总多糖可以促进NK-92MI细胞、Jurkat细胞的体外增殖,同时抑制其体外凋亡,表明西洋参总皂苷和总多糖参与免疫调节,这与现有文献报道研究一致[7-11]。研究发现,西洋参总皂苷与总多糖对NK-92MI细胞、Jurkat细胞体外增殖促进作用与体外凋亡抑制作用规律相类似,均在适宜质量分数时促进体外增殖、抑制体外凋亡作用,且作用与药物质量分数直接相关;但高于适宜质量分数时则无作用,甚至可能产生反作用;而低于适宜质量分数时无作用或作用不明显。

笔者对西洋参总皂苷和总多糖进行比较发现,西洋参总皂苷的抗免疫作用明显大于总多糖。西洋参总皂苷在质量分数为145 mg/L和73 mg/L时对NK-92MI细胞和Jurkat细胞表现出最佳的促进体外增殖的作用,而西洋参总多糖需要达到1 202 mg/L和601 mg/L,明显大于总皂苷的质量分数,提示较大质量分数的总多糖才具有较好的免疫调节作用,表明总皂苷可能是西洋参发挥免疫作用的主要药效成分。西洋参中含有众多的皂苷类成分如Rb1、Rg1、Rb2、Rc、Rd、Rh1等。研究表明,皂苷Rb1 能增强细胞免疫力,对ConA刺激的T细胞增殖具有明显的抑制作用,呈剂量依赖性;同时Rb1还能显著抑制H2O2诱导的T细胞的凋亡进程,呈剂量依赖性[12-13]。此外,任杰红等[14]证实了Rg1可提高实验动物机体免疫力,有免疫促进作用。

本研究初步探讨了西洋参总皂苷和总多糖对NK-92MI细胞、Jurkat细胞的体外增殖、凋亡作用,为西洋参的临床应用提供了参考依据,具有一定的临床意义,但是存在许多不足。由于免疫细胞有多种,本实验中仅选用了常用的Jurkat细胞和NK-92MI细胞,西洋参总皂苷和总多糖对其他免疫细胞如B细胞、THP-1细胞、巨噬细胞等是否也具有相同的免疫作用尚需进一步研究。本课题组下一步将对其他免疫细胞进行研究,同时探讨不同成分之间的配伍对免疫细胞的作用(是协同增效、相互抵消还是拮抗),以期为西洋参药效的物质基础提供理论支撑。