杨树腐烂病病原菌的分离及拮抗菌的筛选

张迪 冯爽 何可

摘 要：杨树是我国北方常用的改善生态环境树种，也是国内木材生产主要树种之一。杨树腐烂病是一直危害杨树的主要病症。本文从杨树腐烂病入手，分离其病原菌并结合当下对于植物内生细菌的研究，进一步探索植物内生拮抗菌为生物防治提供的有效新思路。

作者简介：

张迪（1988.03），男，吉林双辽，汉族，大学本科，营林工程师，营林生产方向，安图森林经营局岛安林场工作。

通讯作者：冯爽（1989.04），女，吉林双辽，汉族，大学本科，营林工程师，营林生产方向，安图森林经营局天保管护大队工作。

何可（1989.06），女，吉林省通榆县，满族，大学本科，营林工程师，天然林保护部，副部长，营林方向，主要从事天然林保护相关工作，安图森林经营局工作。

1 实验材料试剂

1.1 实验材料

（1）病原菌分离的植物材料：采自安图森林经营局岛安林场内，杨树腐烂病发病时期的枝干发病部位。

（2）内生细菌的分离材料：采自安图森林经营局岛安林场内健康杨树的根、茎、叶。

1.2 供试培养基及配方

（1）病原菌分离：马铃薯蔗糖培养基（PDA）。马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g、琼脂粉15.0g、水1000mL；

（2）内生细菌分离：牛肉膏蛋白胨培养基（NA）。牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂粉15.0g、PH值7.3±0.1。

2 研究方法

2.1 杨树腐烂病病原菌的分离

采用组织分离法。于紫外线杀菌30min后的无菌室内进行操作，在超净工作台上将采集的树皮病斑样本清洗干净，用无菌剪刀剪成大小为0.5mm×0.5mm的小块，然后进行表面消毒。在无菌玻璃器皿中先用70%酒精浸泡30s，用无菌镊子将病组织块移入0.1%升汞溶液中浸泡3min，然后将升汞溶液倾倒出去，用无菌水洗30s，冲洗4次，尽可能冲去酒精和升汞的残留物。

表面消毒结束后，用无菌镊子夹取病组织块摆放于注有PDA培养基的培养皿表，倒置于28℃恒温培养箱内培养。观察，待长出菌落后，选择不同菌落，挑取菌落边缘的菌丝分别转移至新的PDA培养基平板上继续培养，获得分离菌株。

2.2 杨树腐烂病病原菌的纯化

采用稀释纯化法。将分离出来的不同菌株培养至菌落基本长满平板后，直接在平板内加入少量的无菌水，用无菌接种铲将菌落融入无菌水中，配制成菌悬液，再用无菌水将菌悬液稀释。用显微镜观察，稀释到每个视野中尽量只有一个分生孢子时，把稀释的菌悬液滴入新的PDA培养基平板上，用无菌涂布器均匀涂抹，倒置于28℃恒温培养箱内培养。依此方法純化3次后，挑取菌饼置于PDA斜面培养基上培养，待长出菌苔后，将斜面试管移入冰箱4℃冷藏层保存。

2.3 分离菌的致病性测定

真菌接种孢子悬液的配制：将纯化的真菌在PDA培养基上培养7d左右，用1mL的无菌水将平板上的孢子冲洗下来，混入20mLPDA液体培养基内，振荡培养（28℃，180r/min36h），用无菌水稀释至浓度为1.0×108个/mL左右的孢子悬浮液。

采用离体枝条接种法。取健康新鲜的杨树枝条，先用水把枝条表面冲洗干净，再用70%酒精和0.1%的升汞分别进行表面消毒，无菌水冲洗3次，晾干。将枝条剪成15cm长的小段，两端都用石蜡封好，用无菌接种针在枝条上划出伤口，将制成的孢子悬液涂抹在这些伤口上，以无菌水涂抹做对照。接种后置于无菌托盘内，覆盖无菌湿纱布保湿，再以保鲜膜封好，28℃保湿培养，分别在6d、8d、10d观察发病情况并记录病斑大小。

2.4 杨树内生细菌的分离纯化

取健康杨树的根、茎、叶，用70%的酒精表面清洗后，剪成0.5～1cm的枝段，浸泡在70%的乙醇中1min，再用3.25%的次氯酸钠浸泡15min，用无菌蒸馏水冲洗4次，放置在PDA平板上培养。从上述培养基平板里挑出没长出微生物菌落的（说明表面消毒彻底）部分放入已灭菌的研钵中，加入45mL无菌水，碾碎，搅拌，静止，将上清液涂抹于NA培养基表面，倒置于28℃的恒温箱中培养，每个处理3次重复。24h后将长出的特征不同的菌落进行划线纯化，此操作进行3次后，获得纯化菌株转至NA斜面培养基，待长出菌落后置于4℃冷藏保存备用。

2.5 室内拮抗菌筛选

在PDA平板上培养7d的杨树腐烂病菌菌落上，用打孔器打出直径5mm的菌碟，放置于新的PDA平板中间，在距培养皿边缘10mm处点接内生细菌菌株（2个点对称），设只接病原菌的为对照，置于28℃恒温箱中培养，培养第5天测杨树腐烂病菌菌落宽度，并计算抑菌率。

3 结果与分析

3.1 杨树腐烂病病原菌分离及致病性检测

对采集回实验室的病树皮进行组织分离后，共纯化出4株真菌，分别编号为F1-4。致病性测定结果显示，在接种6d时，观察，均未有病斑产生；接种8d时观察，F1、F2、F4、菌株与对照一样未表现异常，而F3菌株接种处开始有明显的病斑产生，病斑与杨树腐烂病初期症状一致，也产生酒糟味；接种10d时，F1、F2、F4、菌株与对照仍未有异常表现，F3菌株侵染产生的病斑有明显的扩大。说明分离出的4株菌中只有F3菌株对杨树枝条具有侵染活性，并且产生了与杨树腐烂病一致的症状。

按照柯氏法则，将接种发病的杨树枝条再分离，获得的菌株性状与第一次分离到的F3菌株一致，从而确定再次分离的菌株即为杨树腐烂病的病原菌，是下一步实验的病原菌。

3.2 杨树内生细菌的分离

通过对内生细菌的分离，在健康杨树的根、茎、叶中均分离出一定菌群密度的内生细菌，根部菌群密度为1.85×104Cfu·gfw?1，茎的菌群密度为1.22×104Cfu·gfw?1和叶的菌群密度为1.13×104Cfu·gfw?1，可见根部的菌群密度要高于茎和叶部的菌群密度，存在较大差异，总体呈现根部＞茎部＞叶部的趋势。

从分离出的细菌中找出菌落有差异的菌株进行纯化，共纯化出26株菌株，其中，根部15株（编号为G1～15）、茎部7株（编号为J1～7）、叶部4株（编号为Y1～4）（表1）。

3.3 杨树腐烂病菌内生拮抗细菌的筛选

利用平板拮抗法，筛选杨树腐烂病菌F3的拮抗细菌，从抑菌率来看（见表2），26株菌中，只有G2、G5、G8、G11、G14、J4、J7、Y1这几个菌株有一定的抑菌作用，从杨树不同器官来看，在根、茎、叶分离出的内生细菌中筛选出具有拮抗作用的菌株数量分别为5、2、1，根中所含的拮抗菌数量占总菌数的百分比最高，为19.2%。其中抑菌率＞50%的有3株菌，分别是G2、G8、G14，均分离自根部，而茎和叶中分离出的细菌具有拮抗活性的菌株数量一方面较少，另一方面表现的拮抗活性也较低。

4 结论

从观察到杨树腐烂病症状的杨树病斑上分离到4株真菌，按照柯氏法则进行致病性测定后，确定F3菌株为病原菌，并从再次发病的病斑上分离到该菌。

从健康杨树的根、茎、叶中分离到大量的内生细菌，纯化出26株菌落差异较大的菌株，根部15株、茎部7株、叶部4株。

通过平板拮抗，在26株内生细菌中有8株菌对杨树腐烂病菌有抑菌作用，表现出一定的抑菌率，抑菌率＞50%的菌株菌分离自杨树根部。