外施α-酮戊二酸对盐胁迫下海滨锦葵生长、碳氮磷养分积累及其计量关系的影响

吴雨露， 扈嘉鑫， 陈宇熙， 郑炳松， 闫道良

（浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室，杭州 311300）

土壤盐渍化已成为制约植物生长发育及产量的主要环境问题，研究植物对盐渍化土壤的适应机制并建立相应的抗盐调控技术对植物的生产至关重要。在诸多的抗盐调控技术中，化学调控因其方式的可调控性和技术的综合性而备受关注[1]。α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，KG）作为有机碳源物质，能够被植物直接吸收而进入三羧酸循环，在氮代谢中起着重要的作用。α-酮戊二酸是植物氨同化必需的碳架及信号分子，广泛参与了植物碳（C）、氮（N）代谢的调节，是协调碳、氮两大代谢系统的关键调节物质[2]。研究表明，外源施用α-酮戊二酸可以明显提高水稻体内氨同化酶的活性，同时铵吸收与同化能力也明显加强，对植物氮代谢有明显的调节作用，并增强其对盐渍逆境的适应[3‑4]。黄楠等[5]、吴婷婷等[6]的研究表明，外施一定水平的α-酮戊二酸可以显著提高铁皮石斛的产量和品质。

海滨锦葵（Kosteletzkya virginica）是一种集油料、造纸、药用、观赏与改良盐碱地生态环境为一体的重要经济耐盐植物[7]，目前对海滨锦葵的研究主要集中在抗盐生理及分子机制等方面[8-10]，关于海滨锦葵栽培调控的生理鲜有报道。α-酮戊二酸作为有机碳肥，能够调节因植物“碳饥饿”导致C、N、磷（P）间的化学计量失衡，从而提高作物产量、品质及抗逆性。本课题组前期研究表明，氮亏缺是影响沿海滩涂海滨锦葵生长发育的重要限制因子[11]。为此，本研究以海滨锦葵幼苗为材料，通过模拟盐胁迫下施用有机碳肥α-酮戊二酸对海滨锦葵生长及对C、N、P 养分吸收及其之间化学计量平衡关系的影响，以期为将来利用α-酮戊二酸调控盐碱地植物的生长及其对C、N、P 养分的吸收利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用海滨锦葵种子购自江苏盐城盐土农业公司。供试塑料钵，规格为12 cm（直径）×11 cm（高），购自浙江卡尔生物技术有限公司。供试基质河沙均为洗净无杂质河沙。试剂α-酮戊二酸(99.9%)购自上海阿拉丁试剂有限公司，分析纯；氯化钠（NaCl）购自浙江卡尔生物技术有限公司，主要成分为99.9%的NaCl，分析纯。所用营养液采用Hoagland 配方，配制所需对照及NaCl溶液。

1.2 试验设计

选取当年收获、籽粒饱满完好的海滨锦葵种子，表面消毒后温室催芽，挑选萌发一致的种子播种于塑料钵内，钵内基质为洗净的河沙。出苗后每钵保留长势一致幼苗5~7 株，待幼苗有3~4 片真叶完全展开后，分别用0、5、15 g·L-1NaCl 溶液和0、10、20 mg∙L-1α-酮戊二酸处理，共设置9 组处理，具体信息详见表1。试验中每隔3 d 浇灌NaCl 溶液，直至其刚好从钵底流出，以尽可能减少盐在基质中的积累，保证基质中盐水平恒定；在盐处理后的第2天，喷施α-酮戊二酸，使叶面完全湿润。每个处理5 个重复（5 个营养钵），共45 钵。所有处理的植物材料置于人工气候箱内，箱内昼/夜温度为（27±1）℃/（22±1）℃，相对湿度为60%~70%。处理45 d后，采样测定并分析。

表1 试验组设置情况Table 1 Setting of experimental group

1.3 指标测定方法

收获的海滨锦葵根部泥沙用流动自来水小心洗净，再用蒸馏水冲洗2遍后于120 ℃烘箱中杀青20 min，转至80 ℃烘干至恒重。用直尺测定株高(cm)，用千分之一电子秤称量植株生物量(干重,mg)。根冠比、相对生长率（%）、比叶重采用下面公式计算。用重铬酸钾氧化-外加热法测定植物全碳含量[12]；采用硫酸-双氧水消解，凯氏法测定植物中总氮含量；ICP-AES(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry)分析仪测定植物磷、钾、钠元素含量[13]，计量单位为g·kg-1DW。

1.4 数据处理

用SPSS 13.0 对数据进行统计分析，处理间差异显著性(P<0.05)采用Duncan 多重比较。指标间相关性采用Pearson 分析。所有数据均是各处理平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 α-酮戊二酸处理对盐胁迫条件下海滨锦葵生长的影响

由表2可见，与对照相比，NaCl处理会显著抑制海滨锦葵植株生长，其株高和植株相对生长率均显著降低(P<0.05)。其中，15 mg∙L-1NaCl 处理的株高仅为对照的42.82%。另外，施加α-酮戊二酸后并没有明显改善单盐胁迫下海滨锦葵的株高和相对生长率。

表2 不同α-酮戊二酸处理下的海滨锦葵株高Table 2 Plant height of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate

2.2 α-酮戊二酸处理对盐胁迫条件下海滨锦葵生物量积累的影响

由表3可知，与对照相比，单施α-酮戊二酸显著提高了海滨锦葵的生物量，NaCl 盐胁迫则显著降低了其生物量（S5 处理除外）。盐胁迫下，外施α-酮戊二酸增加了海滨锦葵的总生物量，但并没有明显缓解盐对海滨锦葵生物量积累的抑制效应。在NaCl 浓度为15 g∙L-1处理下，外源喷施20 mg∙L-1α-酮戊二酸显著提高了海滨锦葵的根生物量，是15 g∙L-1NaCl 胁迫下的1.4 倍，说明α-酮戊二酸促进了高盐胁迫下海滨锦葵根生物量的积累，这与该条件下海滨锦葵具有较高的根冠比相一致。同时，研究发现外施20 mg∙L-1α-酮戊二酸显著增加了5 g∙L-1NaCl 胁迫下的海滨锦葵叶生物量，说明喷施适宜水平的α-酮戊二酸有利于减缓盐胁迫对植株叶生物量积累的抑制，这对植株碳同化正常功能的发挥有着重要的作用。

表3 盐胁迫条件下不同α-酮戊二酸处理的海滨锦葵单株生物量、根冠比和比叶重Table 3 Biomass per plant， root shoot ratio and specific leaf weight of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

比叶重是反映植物光合能力的重要指标。与对照相比，盐胁迫显著增加了海滨锦葵的比叶重，外施α-酮戊二酸后明显提高了盐胁迫下的比叶重，说明海滨锦葵对盐有一定的适应性，外施α-酮戊二酸对提高叶的光合性能有重要的作用。

2.3 α-酮戊二酸处理对盐胁迫条件下海滨锦葵C、N、P化学计量特征的影响

植物对营养元素的吸收与环境中养分的供应有密切的关系，在养分供应缺乏的情况下往往具有较高的养分利用效率。由表4 可见，与对照相比，外施20 mg∙L-1α-酮戊二酸显著提高了植株的总C 含量，是对照的1.07 倍。在15 g∙L-1NaCl 高盐胁迫下，外施α-酮戊二酸对海滨锦葵总C 的积累具有显著效果，是该盐梯度（S15 处理）胁迫下的1.1 倍。外施α-酮戊二酸对海滨锦葵总N 含量有明显的影响，即增加了植株的总N含量，尤其是20 mg∙L-1α-酮戊二酸施加后，植株的总N含量显著高于对照，是对照的1.04 倍；另外，外施10 mg∙L-1α-酮戊二酸仅明显提高了5 g∙L-1NaCl 低盐胁迫下海滨锦葵叶片的N 与P 含量。以上结果表明α-酮戊二酸对盐胁迫下海滨锦葵叶片N、P含量的影响受到用量的影响。15 g∙L-1NaCl 胁迫下，外施20 mg∙L-1α-酮戊二酸可以显著提高海滨锦葵的C/N 和C/P，说明高盐胁迫下施加适当水平的α-酮戊二酸能显著提高海滨锦葵对N、P的利用效率，产出更多的碳水化合物。10、20 mg∙L-1α-酮戊二酸显著提高了15 g∙L-1NaCl胁迫下海滨锦葵的N/P，与仅施加15 g∙L-1NaCl 胁迫相比，差异明显(P<0.05)，说明α-酮戊二酸促进了高盐胁迫下海滨锦葵对磷的利用效率。

表4 盐胁迫下不同α-酮戊二酸处理下的海滨锦葵叶片碳、氮、磷化学计量特征Table 4 Stoichiometric characteristics of carbon， nitrogen and phosphorus in leaves of K. virginica plants treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

2.4 α-酮戊二酸处理对盐胁迫条件下海滨锦葵Na+、K+含量的影响

由表5可见，外施α-酮戊二酸不同程度地提高了海滨锦葵叶片中的K+含量，其中，施加10 mg∙L-1α-酮戊二酸显著增加了叶片K+含量，是对照处理的1.23倍。在5 g·L-1NaCl处理下，施加10 mg∙L-1α-酮戊二酸显著增加了叶片的K+含量，说明α-酮戊二酸可以促进盐胁迫下叶片对K+的吸收。但是，只喷施α-酮戊二酸并没有显著影响叶片中Na+的含量；在5 g·L-1NaCl 低盐胁迫下，施加20 mg∙L-1α-酮戊二酸显著降低了该盐度胁迫下的Na+含量。对K+/Na+而言，只喷施α-酮戊二酸能显著增加其比值，在盐胁迫下施加α-酮戊二酸并没有显著影响K+/Na+比值。在盐环境下，植物体内维持相对较高且稳定的K+/Na+是保证植物正常酶活性的必要条件，本试验中，α-酮戊二酸对于盐胁迫的海滨锦葵没有通过促进K+/Na+值来提高植株对盐胁迫的适应，这可能与海滨锦葵本身对一定含量的盐具有较强的适应性有关。

表5 盐胁迫下α-酮戊二酸处理下的海滨锦葵叶片Na+、K+含量及其化学计量特征Table 5 Na+， K+ contents and their stoichiometric characteristics in leaves of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

2.5 α-酮戊二酸处理对盐胁迫条件下海滨锦葵各指标间的相关性分析

叶片是植物进行光合作用的主要功能器官。在盐胁迫下，植物体内的Na+、K+含量与C、N、P养分含量及其化学计量间的平衡对海滨锦葵的正常生长发育极其重要。相关性分析（表6）发现，海滨锦葵叶片总N 与总P 呈极显著正相关(P<0.01)，与叶片N/P呈极显著负相关(P<0.01)，而与叶K+/Na+呈极显著正相关(P<0.01)；海滨锦葵叶片总P含量与Na+含量呈极显著负相关，与叶K+含量呈极显著正相关。叶片中N/P与K+/Na+呈极显著负相关，说明在α-酮戊二酸处理下，叶片总N、总P的积累和平衡与环境中Na+对盐生植物海滨锦葵生长有协同作用。

表6 盐胁迫下不同α-酮戊二酸处理下的海滨锦葵叶N、P、Na+、K+化学计量特征相关性分析Table 6 Correlation analysis of stoichiometric characteristics of N， P， Na+， K+ in leaves of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

3 讨论

α-酮戊二酸是植物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，参与细胞内多种化学反应，具有多种生理功能。对酿酒酵母的培养发现，添加一定水平的α-酮戊二酸后，细胞的代谢活性增强，总抗氧化能力和氨基酸含量等指标也得以提高[14]。对其他植物的研究也表明，外施α-酮戊二酸可以明显提高植物体内氨同化酶的活性，同时铵吸收与同化能力也得到明显加强，对植物氮代谢有明显的调节作用[15‑16]。同样，外施一定水平的α-酮戊二酸对逆境下植物的生长具有重要的正向调节作用。外施α-酮戊二酸增强了干旱胁迫下小麦氮代谢强度，减缓了干旱胁迫对小麦产量降低的影响，增强其对干旱逆境的适应[17‑18]。另外，外施α-酮戊二酸改善了小麦低氮胁迫下植株的生长，促进了逆境下小麦的氮代谢，提升了小麦的产量[19]。本研究表明，在盐胁迫下外施α-酮戊二酸虽然增加了海滨锦葵的总生物量，但并没有明显缓解盐对海滨锦葵生物量积累的抑制效应，这可能与不同物种的生物学特性有关。在15 g∙L-1盐处理下，外施20 mg∙L-1α-酮戊二酸则明显提高了海滨锦葵的根生物量，说明α-酮戊二酸有利于海滨锦葵把更多碳物质向根转移，作为后备能源物质储存起来，以更好地维持盐渍环境下生命的延续，研究结果为α-酮戊二酸提高盐胁迫环境下海滨锦葵的适应性机制提供了参考。

盐胁迫是影响植物生长的重要环境因素，植物通过积累更多的K+，以减轻Na+对植物的离子毒害[20‑21]。本研究表明，外施α-酮戊二酸显著提高了低盐胁迫下（5 g·L-1NaCl）叶片的K+含量，但对K+/Na+的影响并不明显，这可能与海滨锦葵具有一定的喜盐性有关。同时，外施20 mg∙L-1α-酮戊二酸分别显著增加了低盐和高盐胁迫下海滨锦葵的比叶重，说明外施α-酮戊二酸有利于缓解盐胁迫对叶片光合性能的抑制作用，从而有利于碳物质合成和积累。C/N 和C/P 反映了植物对N、P的利用效率，效率越高，碳物质的积累越多。本研究表明，外施20 mg∙L-1α-酮戊二酸可以显著提高高盐胁迫下（15 g·L-1NaCl）海滨锦葵的C/N 和C/P，说明高盐胁迫下施加适量的α-酮戊二酸能明显提高海滨锦葵对N、P 的利用效率，增加了碳物质的合成和积累，从而促进了植株生物量的提高。

近年有研究表明，外施α-酮戊二酸不但可以提高动物体内蛋白质的沉积和免疫能力[22]，而且α-酮戊二酸作为有机碳肥的研究与实践利用也取得了一定的成果，它不但可以缓解逆境对植物生长的抑制作用，而且在增产和提高植物品质方面也得到了证实[23-25]。本研究发现，喷施α-酮戊二酸后，海滨锦葵叶片总N 含量与K+/Na+呈现极显著正相关，说明喷施α-酮戊二酸后在促进N 含量的同时，K+/Na+值也得到了提高，从而有利于维持盐胁迫下叶片K+的平衡，缓解Na+对细胞的毒害作用。同时，N 与P 含量呈极显著正相关，施加α-酮戊二酸后，在提高N含量的同时，也促进了海滨锦葵对P的吸收利用，而植株吸收、积累一定量的P，有利于提高植株对逆境的适应。

综上所述，外源喷施α-酮戊二酸促进了海滨锦葵植株的生物量积累。在低盐（5 g·L-1NaCl）胁迫下，外施α-酮戊二酸显著提高了植株的K+含量，增加了K+/Na+。其中，施加20 mg∙L-1α-酮戊二酸可以显著增加盐胁迫下海滨锦葵的比叶重，说明α-酮戊二酸对盐胁迫下海滨锦葵的光合性能有较好地促进作用。同时，α-酮戊二酸提高了叶片对N、P的利用效率，增强了碳物质的合成。