ET-1对血管平滑肌细胞ANO1表达的影响及机制

吴雪　张文秀　赵慧　韩晓华

［摘要］目的探討内皮素-1（ET-1）对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙激活氯通道anoctamin 1（ANO1）表达的影响及机制。方法以不同浓度（0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 nmol/L）ET-1处理VSMCs 24 h或用1.0 nmol/L ET-1处理不同时间（1、6、12、24、48 h），观察ET-1对ANO1蛋白表达的影响。用磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路，检测磷酸化AKT（p-AKT）和ANO1蛋白表达的变化。采用组织贴块法进行大鼠胸主动脉VSMCs的原代培养，采用Western blot法检测ANO1蛋白水平。结果0.1～1 000.0 nmol/L ET-1处理明显促进ANO1蛋白表达（F=4.302，P<0.05），以1.0 nmol/L ET-1作用最为显著（q=8.707，P<0.05）。用1.0 nmol/L ET-1处理细胞不同时间后，ANO1蛋白表达水平增加（F=4.856，P<0.05），其中ET-1作用12～48 h ANO1表达差异具有统计学意义（q=2.903～5.673，P<0.05）。采用LY294002（10 μmol/L）预处理后，与ET-1组相比较，LY294002+ET-1组p-AKT和ANO1蛋白的表达水平均显著降低（F=26.340、12.460，q=11.220、8.512，P<0.05）。结论ET-1对VSMCs的ANO1表达具有明显的上调作用，该作用可能和激活PI3K/AKT信号通路有关。

［关键词］内皮缩血管肽1；血管；肌细胞，平滑肌；anoctamin-1蛋白

［中图分类号］R331.32［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0379-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.016［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230303.0911.004.html;2023-03-0317：31：07

EFFECT OF ENDOTHELIN-1 ON THE EXPRESSION OF ANOCTAMIN 1 IN VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS OF RATS AND ITS MECHANISMWU Xue， ZHANG Wenxiu， ZHAO Hui， HAN Xiaohua（Department of Physiology and Pathophy-siology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of endothelin-1 （ET-1） on the expression of anoctamin 1 （ANO1） in vascular smooth muscle cells （VSMCs） of rats and its mechanism.MethodsVSMCs were treated with different concentrations of ET-1 （0.1， 1.0， 10.0， 100.0， and 1 000.0 nmol/L） for 24 h or treated with 1.0 nmol/L ET-1 for different times （1， 6， 12， 24， and 48 h） to observe the effect of ET-1 on the protein expression of ANO1. A phosphatidylinositol-3 kinase （PI3K） blocker， LY294002， was used to block the PI3K/AKT pathway， and the protein expression levels of phosphorylated AKT （p-AKT） and ANO1 were measured. The tissue block method was used for the primary culture of VSMCs from the thoracic aorta of rats， and Western blot was used to measure the protein expression level of ANO1. ResultsET-1 treatment at the concentrations of 0.1-1 000.0 nmol/L significantly promoted the protein expression level of ANO1 （F=4.302，P<0.05）， and 1.0 nmol/L ET-1 showed the most remarkable effect （q=8.707，P<0.05）. After the cells were treated with 1.0 nmol/L ET-1 for different times， there was a significant increase in the protein expression level of ANO1 （F=4.856，P<0.05）， and the cells treated with ET-1 for 12-48 h showed the greatest change in the expression of ANO1 （q=2.903-5.673，P<0.05）. After pretreatment with LY294002 （10 μmol/L）， the LY294002+ET-1 group had significant reductions in the protein expression levels of p-AKT and ANO1 compared with the ET-1 group （F=26.340，12.460，q=11.220，8.512，P<0.05）.ConclusionET-1 can significantly upregulate the expression of ANO1 in VSMCs， which may be associated with activation of the PI3K/AKT signaling pathway.

［KEY WORDS］endothelin-1; blood vessels; myocytes， smooth muscle; anoctamin-1

高血压是目前发病率最高的心血管疾病之一，血管平滑肌细胞（VSMCs）功能异常在高血压的发生发展中起关键作用[1-2]。anoctamin 1（ANO1）是2008年发现的钙激活氯通道，广泛分布于各种血管组织[3]。研究表明，ANO1参与正常血管舒缩功能的调节[4-5]；此外它还参与多种高血压模型的血管重构过程[6-8]。研究发现，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）可以明显上调正常大鼠VSMCs的ANO1表达，该作用可能与激活磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT信号通路有关[6，9]。内皮素-1（ET-1）是一种由血管内皮细胞合成和分泌的血管活性物质[10-11]。ET-1可以通过升高胞内钙水平激活HEK293细胞的钙激活氯通道[12]，故我们推测ET-1可能可以上调VSMCs的ANO1蛋白表达水平。本研究利用原代培养的VSMCs，观察了ET-1对ANO1表达的影响并初步探讨其可能机制。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

ET-1购自上海AbMole公司；ANO1抗体由上海Abcam公司提供；β-actin抗体由北京博奥森公司提供；磷酸化AKT（p-AKT）和AKT抗体由上海Cell Signaling Technology公司提供；DMEM高糖培养粉购自上海Gibco公司；胎牛血清购自美国BI公司；BCA蛋白检测试剂盒由上海Thermo公司提供；RIPA裂解液购自上海碧云天生物科技研究所；二甲基亚砜（DMSO）购自北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。实验所用仪器包括CO2培养箱、超净工作台、Eppendorf高速离心机、37 ℃恒温孵育箱以及Western显影仪等。

1.2VSMCs的原代培养

选取體质量80～100 g的Wistar大鼠，以水合氯醛腹腔注射麻醉。在体积分数为0.75的乙醇中浸泡消毒后，迅速放入无菌超净台内。分离胸主动脉，将其放入含有DMEM培养液的预冷玻璃皿中，剥离血管外脂肪和结缔组织，沿中线剪开，轻柔刮下内皮，用眼科剪将其剪成大小约1 mm3小块，平铺于25 cm2培养瓶底部，加入4～5 mL含有体积分数0.20胎牛血清的DMEM高糖培养液后，直立放入培养箱内，5～6 h后翻瓶，培养1周左右，在显微镜下可看到贴壁组织块周围有VSMCs爬出，细胞融合达到60%～70%时进行传代，选择第5～8代生长良好的细胞进行后续实验。

1.3实验分组与药物处理

为观察不同浓度ET-1对ANO1蛋白表达影响，实验分对照组（无药物处理）和不同浓度ET-1处理组（分别加入0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 nmol/L ET-1处理24 h）。为观察ET-1作用不同时间对ANO1蛋白表达的影响，实验分为对照组（无药物处理）和ET-1处理不同时间组（加入1.0 nmol/L ET-1分别处理1、6、12、24、48 h）。为探讨ET-1上调ANO1表达是否和激活PI3K/AKT通路有关，实验分为对照组（无药物处理）、ET-1组（ET组，用1.0 nmol/L ET-1处理24 h）、LY294002+ET-1组（LY+ET组，在ET-1处理前先加入10 μmol/L LY294002，其余同ET组）。ET-1先用无菌水配成1 mmol/L母液，使用前再用DMEM培养液稀释到终浓度。LY294002先用DMSO配成10 mmol/L母液，使用前再用DMEM培养液稀释。

1.4Western blot检测p-AKT和ANO1蛋白表达

药物处理结束后，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。所有样品均以20 μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜。用含有100 g/L脱脂奶粉的TBST封闭1 h后，分别加入ANO1（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗，4 ℃摇床孵育过夜。以TBST洗膜3次，加HRP标记的二抗，室温孵育1 h，ECL发光液显影。用Image J软件分析条带的灰度值，结果以ANO1/β-actin和p-AKT/AKT的比值表示。实验重复3次。

1.5统计学分析

应用Graph Pad Prism 5.0软件对数据进行统计学分析，结果以±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组数据比较，采用Tukey法进行组间两两比较。P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度ET-1对ANO1蛋白表达的影响

细胞经0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 nmol/L ET-1处理24 h后，ANO1/β-actin比值分别为1.02±0.11、1.25±0.14、0.94±0.14、0.89±0.09和1.00±0.11（n=3），均较对照组（0.84±0.19）升高（F=4.302，P<0.05），其中以1.0 nmol/L ET-1作用最显著（q=8.707，P<0.05）。见图1。

2.2ET-1处理不同时间对ANO1蛋白表达水平的影响

细胞经1.0 nmol/L ET-1处理1、6、12、24、48 h后，ANO1/β-actin比值分别为0.88±0.14、0.90±0.19、1.05±0.21、1.26±0.08和1.13±0.13（n=3），均较对照组（0.83±0.21）升高（F=4.856，P<0.05），其中ET-1作用12～48 h ANO1表达差异具有显著性（q=2.903～5.673，P<0.05）。见图2。

2.3LY294002对ET-1诱导的ANO1表达的影响

对照组、ET组和LY+ET组的p-AKT/AKT比值分别为1.06±0.03、1.24±0.11、0.80±0.02（n=3），差异具有统计学意义（F=26.340，P<0.05）。与对照组相比，ET组p-AKT/AKT比值明显升高（q=4.541，P<0.05）；与ET组相比，LY+ET组p-AKT/AKT比值则明显降低（q=11.220，P<0.05）。对照组、ET组和LY+ET组ANO1/β-actin比值分别为0.99±0.09、1.21±0.08、0.84±0.56（n=3），差异具有统计学意义（F=12.460，P<0.05）。与对照组相比较，ET组ANO1/β-actin比值明显升高（q=5.107，P<0.05）；与ET组相比较，LY+ET组的ANO1/β-actin比值明显降低（q=8.512，P<0.05）。表明LY294002阻斷PI3K/AKT通路后，ET-1诱导的ANO1蛋白表达明显被抑制。见图3。

3讨论

长期的高血压可导致心、脑、肾、眼等多器官损伤，具有较高的致死率和致残率，其特征性变化包括小动脉的管壁增厚、管壁/管腔比值增大、微小动脉数量减少等[13-14]。VSMCs作为血管壁的主体细胞，其异常收缩和增殖迁移在高血压的发生发展中发挥重要作用[15-16]。体内多种因素，如血流动力学改变、血管活性物质（AngⅡ、ET-1）、炎症因子和生长因子（如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等），均和VSMCs功能异常密切相关[2]。

钙激活氯通道ANO1在高血压发病中作用的研究，是目前国际上的一个研究热点。有大量研究表明，ANO1也是参与VSMCs功能调控的重要因素[3-6，17]。ANO1激活可导致氯离子外流和细胞膜除极，诱导VSMCs收缩，而抑制其功能性表达则可通过舒张血管而降低血压[17-18]。在自发性高血压大鼠中，VSMCs上ANO1功能性高表达促进高血压形成[6]。此外，ANO1还可作为一种细胞增殖调节因子参与VSMCs增殖，促进血管重构过程和降低血管弹性[19-21]。但是关于VSMCs上ANO1高表达的机制尚不明确。本团队前期研究发现，AngⅡ能通过结合血管紧张素Ⅰ型受体，显著上调正常大鼠VSMCs的ANO1表达，该作用可能与激活AKT和ERK信号通路有关[9]。

和AngⅡ相似，ET-1是内皮细胞分泌的最重要的血管活性物质，具有很强的缩血管效应，同时ET-1也是一种有丝分裂原，在维持血管功能稳态中具有重要作用[10，22-23]。ET-1能激活HEK293细胞的钙激活氯通道，因此它很可能是上调ANO1表达的调控因子之一。本实验通过向VSMCs中加入不同浓度的ET-1，观察到ET-1能够明显促进ANO1蛋白表达，以1.0 nmol/L ET-1处理12～48 h作用最为显著。

ET-1可激活两种受体，其中ETA受体主要在平滑肌细胞中表达，ETB受体主要在内皮细胞中表达，二者均是G蛋白偶联受体[24-25]。有研究指出，VSMCs中ETA受体激活介导了肺动脉高压的血管收缩和异常细胞增殖[25-26]。ET-1和VSMCs的受体结合后，首先激活磷脂酶C/三磷酸肌醇通路，导致胞内钙水平升高，后者进一步激活蛋白激酶C、AKT、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路，从而调节VSMCs的各种功能[22-23]。本研究为进一步探讨ET-1上调ANO1表达的可能机制，利用PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路激活，观察了ET-1诱导的ANO1表达的变化。结果表明，抑制AKT激活后，ANO1蛋白表达水平明显降低，提示PI3K/AKT信号通路在上游中介了ET-1诱导的ANO1高表达。

综上所述，ET-1可显著促进原代培养的大鼠VSMCs的ANO1蛋白表达，该作用可能和激活PI3K/AKT信号通路有关。

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（本文編辑马伟平）