Ndfip1在帕金森病模型小鼠黑质中的表达变化

付小敏　曲仂　徐华敏　谢俊霞

［摘要］目的觀察携带人突变型α-突触核蛋白（A53T）的帕金森病（PD）转基因小鼠及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD模型小鼠黑质区Nedd4家族相互作用蛋白1（Ndfip1）的表达变化。方法选取12月龄A53T转基因小鼠和同窝野生型（WT）对照小鼠，采用免疫印迹技术检测小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达变化；选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组，MPTP组小鼠连续5 d给予MPTP腹腔注射（30 mg·kg^-1·d^-1），对照组给予等体积的生理盐水，采用免疫印迹技术检测小鼠黑质区Ndfip1及酪氨酸羟化酶（TH）的蛋白表达变化。结果与WT小鼠相比，A53T转基因小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达降低，差异有统计学意义（t=2.294，P＜0.05）；与对照组相比，MPTP组小鼠黑质区Ndfip1及TH的蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（t=2.149、9.935，P＜0.05）。结论携带人突变型α-突触核蛋白（A53T）的PD转基因小鼠及MPTP诱导的PD模型小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达均下降。

［关键词］帕金森病；Nedd4家族相互作用蛋白1；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶；α突触核蛋白；黑质；小鼠，近交C57BL

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0317-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.014［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230302.1739.007.html;2023-03-0317：03：28

CHANGE IN THE EXPRESSION OF NEDD4 FAMILY-INTERACTING PROTEIN 1 IN THE SUBSTANTIA NIGRA OF A MOUSE MODEL OF PARKINSONS DISEASE  FU Xiaomin， QU Le， XU Huamin， XIE Junxia （Institute of Brain Science and Di-seases， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the change in the expression of Nedd4 family-interacting protein 1 （Ndfip1） in the substantia nigra of human mutant α-synuclein （A53T） transgenic mice with Parkinsons disease （PD） or a mouse model of PD induced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）.MethodsA53T transgenic mice and wild-type （WT） littermates， aged 12 months， were selected， and Western blotting was used to measure the change in the protein expression of Ndfip1 in the substantia nigra. Male C57BL/6J mice， aged 8 weeks， were randomly divided into MPTP group and control group; the mice in the MPTP group were given intraperitoneal injection of MPTP （30 mg·kg^-1·d^-1） for 5 consecutive days， and those in the control group were given an equal volume of normal saline; Western blotting was used to measure the changes in the protein expression of Ndfip1 and tyrosine hydroxylase （TH） in the substantia nigra. ResultsCompared with the WT mice， the A53T transgenic mice had a significant reduction in the protein expression of Ndfip1 in the substantia nigra （t=2.294，P<0.05）. Compared with the control group， the MPTP group had significant reductions in the protein expression of Ndfip1 and TH in the substantia nigra （t=2.149，9.935;P<0.05）. ConclusionThere is a significant reduction in the protein expression of Ndfip1 in the substantia nigra of human mutant α-synuclein （A53T） transgenic mice with PD and a mouse model of MPTP-induced PD.

［KEY WORDS］Parkinson disease; Nedd4 family interacting protein 1; 1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine; alpha-synuclein; substantia nigra; mice， inbred C57BL

帕金森病（PD）是一种常见的神经系统退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的变性，以及α-突触核蛋白（α-syn）异常聚集所致路易小体的形成[1-3]。临床上， PD病人常出现明显的运动迟缓等运动症状，以及抑郁、焦虑等非运动症状[4-8]。到目前为止，PD的病因仍未完全阐明，有研究表明可能涉及遗传、环境、衰老等多种因素[9-12]。Nedd4家族相互作用蛋白 1（Ndfip1）是一种衔接蛋白，因其结构上具有PY模体可被E3泛素连接酶Nedd4的WW结构域识别，从而促进底物蛋白的泛素化降解[13]。近期研究表明，高表达Ndfip1可以保护SH-SY5Y细胞免受鱼藤酮诱导的神经毒性的影响[14]，提示Ndfip1可能在PD中具有潜在的神经保护作用。但Ndfip1在PD动物模型中的表达变

318青岛大学学报（医学版）59卷

化尚未见报道。因此，本实验选用携带人突变型α-syn（A53T）的转基因小鼠观察α-syn突变对黑质中Ndfip1表达的影响，同时选用神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD模型小鼠观察MPTP对黑质中Ndfip1表达的影响，以期为阐明Ndfip1在PD中可能发挥的作用提供新的实验依据。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物A53T转基因小鼠购于美国的Jackson实验室，选用12月龄雄性α-syn A53T转基因小鼠及同窝野生型（WT）小鼠作为研究对象。SPF级雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，体质量（19±1） g，购于北京维通利华公司。所有小鼠均饲养于可自由饮水摄食、室温25 ℃、湿度（50±5）%、昼夜循环光照（12 h/12 h）的SPF级清洁环境中。

1.1.2试剂和仪器MPTP粉末和Ndfip1抗体购自美国Sigma公司，Rabbit Anti-β-actin购于中国Bioss公司，HRP-IgG标记的二抗购于中国爱必信公司，分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液均购于康为公司，ECL发光液、PVDF膜购自美国 Millipore公司，过硫酸铵、四甲基乙二胺、RIPA 裂解液、BCA 试剂盒、Loading Buffer均购自中国碧云天公司。电泳仪、电转仪购自美国 BioRad公司，凝胶成像系统购自美国 UVP公司。

1.2动物分组与处理

选取12月龄雄性WT小鼠作为对照组，α-syn A53T转基因小鼠作为实验组。同时选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为对照组和MPTP组。MPTP粉末用生理盐水配制成浓度为6 g/L的溶液，MPTP组小鼠连续5 d给予MPTP腹腔注射（30 mg·kg^-1·d^-1），对照组小鼠给予等体积的生理盐水[15]。

1.3免疫印迹技术检测Ndfip1以及酪氨酸羟化酶（TH）的蛋白表达

小鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后断头取脑，置于干冰盒中静置5 s后移至冰上，按照小鼠脑图谱迅速取出黑质放入EP管中。称质量后按每毫克25 μL的比例加入RIPA蛋白裂解液，使用研磨机充分研磨后，静置于冰上30 min以充分裂解组织，以12 000 r/min离心35 min后取上清液，应用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度，加入1/4体积的Loading Buffer后95 ℃金属浴5 min。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（80 V、40 min，120 V、90 min）后以湿法转至0.45 μm的PVDF膜上（300 mA、90 min）。用50 g/L的脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入Ndfip1（1∶1 000）、TH（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000）抗体于4 ℃摇床孵育过夜。以TBST溶液洗3次，每次10 min，用山羊抗兔的HRP-IgG二抗（1∶10 000）于室温孵育1 h；以TBST溶液洗3次，每次10 min，然后使用ECL发光液显影。应用Image J软件进行分析，以Ndfip1、TH蛋白与β-actin的比值作为目的蛋白的表达水平。

1.4统计学处理

应用Prism 6软件进行统计学处理，计量资料结果以±s表示，两组間比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1A53T转基因小鼠黑质区Ndfip1的表达变化

免疫印迹技术检测结果显示，12月龄WT小鼠和α-syn A53T转基因小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达水平分别为1.000±0.083（n=6）和0.885±0.080（n=5），与WT小鼠相比，A53T转基因小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达下降约11%，差异有统计学意义（t=2.294，P＜0.05）。

2.2MPTP诱导的PD小鼠黑质区TH和Ndfip1蛋白的表达变化

与对照组相比，MPTP组小鼠黑质区TH蛋白表达下降约64%，差异有统计学意义（t=9.935，P＜0.01）；与对照组相比，MPTP组小鼠黑质区Ndfip1蛋白表达下降约14%，差异有统计学意义（t=2.149，P＜0.05）。见表1。

3讨论

PD是一种复杂的神经退行性疾病，以老年人多见，其特征性的病理变化是中脑黑质区多巴胺能神经元的变性损伤[16]。但迄今为止，其确切的发病机制尚未完全阐明。因此，探究PD的发病机制及寻找新的治疗靶点至关重要。有研究报道，在短暂性的局灶性脑缺血或创伤性脑损伤后，Ndfip1在大鼠脑损伤部位周围幸存的皮质神经元中表达上调，提示Ndfip1可能对残存神经元具有保护作用[17]。

本研究團队前期实验结果表明，Ndfip1在6-羟基多巴胺（6-OHDA）处理的MES23.5多巴胺能细胞中的表达明显降低，其水平降低可能与二价金属铁转运蛋白1（DMT1）的表达上调及多巴胺能神经元的铁沉积有关[18]。但Ndfip1在PD动物模型中的表达及作用尚不清楚。因此，本实验选取α-syn A53T转基因小鼠模型和MPTP诱导的PD小鼠模型研究Ndfip1的表达变化。A53T转基因小鼠携带SNCA点突变基因，可在多个脑区观察到α-syn聚积，该模型可模拟PD的神经病理学改变过程，运动症状出现较晚，是研究PD早期病变的理想动物模型。我们前期的研究结果表明，12月龄A53T转基因小鼠黑质多巴胺能神经元数目未观察到明显变化，而15月龄A53T转基因小鼠黑质多巴胺能神经元数目减少了18.9%，与对照组相比，差异有统计学意义[19]。还有文献报道，2月龄A53T转基因小鼠黑质等脑区中即可出现明显的α-syn聚积所形成的包涵体，但其黑质的TH阳性神经元密度变化不明显，而纹状体中TH阳性末梢明显减少，提示α-syn的异常聚积可导致多巴胺能神经末梢的损伤，这可能是PD发病早期的变化，也可能是A53T转基因小鼠运动症状出现较晚的原因之一[20]。本实验中α-syn A53T转基因小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达与WT小鼠相比下降约11%。MPTP是最早发现的导致神经元损伤的神经毒素，其作用机制是通过抑制线粒体复合体Ⅰ的活性损伤多巴胺能神经元，可用于模拟PD发病进程中多巴胺能神经元损伤的病理变化[15-16]。本实验选用的是亚急性MPTP模型，此模型会出现明显的行为学改变以及严重的神经元损伤，但并无α-syn聚积[21]。本文结果显示，在MPTP诱导的PD小鼠模型中，TH蛋白水平降低约64%，提示多巴胺能神经元受到明显损伤。同时观察到MPTP处理小鼠的黑质区Ndfip1蛋白的表达与对照组相比下降约14%。以上结果表明，两种PD模型小鼠黑质中Ndfip1蛋白的表达出现相似程度的下降。但是A53T转基因小鼠黑质区TH阳性细胞数目减少并不明显，而在MPTP诱导的PD小鼠模型中，黑质区TH阳性细胞数目明显减少，TH蛋白的表达显著下降[15]。这提示两种PD模型小鼠Ndfip1表达下调的机制可能不同。一种可能的机制是，不同PD模型的发病机制及进程不同，A53T转基因小鼠模型主要是模拟α-syn聚积，病程较长，是研究PD早期症状的模型；而MPTP诱导的PD小鼠模型则是亚急性模型，它的发病机制是MPTP在脑内转换为1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+），通过触发线粒体功能障碍引起多巴胺能神经元的损伤，但并无α-syn聚积。提示两种PD模型不同的发病机制可能在Ndfip1表达调控中发挥不同的作用。此外，有研究报道，在短暂性的局灶性脑缺血或者创伤性脑损伤后，Ndfip1在大鼠脑损伤部位周围幸存的皮质神经元中表达上调，这可能是神经元对损伤的一种自主且有效的反应性调控策略[22]。因此我们推测，随着PD的进展，Ndfip1表达可能会出现进行性降低，但急性损伤可能会诱导存活神经元中Ndfip1蛋白的反应性上调。

Ndfip1作为一种衔接蛋白，可以与E3泛素连接酶Nedd4家族蛋白结合参与泛素化过程，降解受损或有害的蛋白。α-syn的异常沉积是PD发病进程中的特征性病理改变。我们的前期研究结果显示，在神经毒素鱼藤酮处理24 h后细胞中出现α-syn的表达增加和Ndfip1的表达减少，而高表达Ndfip1可以抑制α-syn蛋白水平的升高，并拮抗鱼藤酮诱导的TH蛋白水平的下降，保护细胞免受毒性损伤[14]。对Ndfip1神经保护作用的细胞机制研究表明，过表达Ndfip1可抑制MPP+诱导的细胞凋亡，并可与Nedd4-1结合参与泛素化过程而抑制α-syn的表达，提高细胞存活率[23]。此外，Ndfip1还可以在Nedd4-2的泛素化作用下，介导Pten蛋白降解，促进脑缺血后神经元的存活[24]。铁沉积是PD多巴胺能神经元损伤的重要原因之一。有研究报道，在敲除Ndfip1的小鼠大脑神经元中出现明显铁积累，过表达Ndfip1可以招募Nedd4-2并结合铁转入蛋白DMT1，通过泛素化途径介导DMT1降解，抑制细胞铁转运，减少细胞内的铁沉积，从而减轻神经元损伤[25-26]。以上研究提示，Ndfip1可能通过泛素-蛋白酶体途径在细胞凋亡、铁稳态等过程中发挥作用，参与对PD的神经保护，探究Ndfip1在PD中的作用及可能的机制将为预防和治疗PD提供新的作用靶点。

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（本文編辑 马伟平）