苦胆草多糖活性炭脱色工艺研究

黄丽金 陈贵元，2*

（1大理大学基础医学院，云南大理 671000；2云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000）

苦胆草（Andrographis paniculata）又称印度草、穿心莲、苦草、春莲、秋莲。穿心莲因其食入一小片叶子，就可以感受到那直击心灵的苦，故称为“穿心莲”[1]。该植物广泛分布于我国福建、广东等南方地区，有着“大南药”之称[2]。在民间这种植物可直接作为药材使用，治疗感染性疾病和解蛇毒。苦胆草中含有多种活性成分：多酚、蛋白质、内脂、多糖、黄酮等[3]，其中苦胆草内脂有着多种药理作用，如抗血栓、镇痛、清热解毒、抗高血糖、抗癌、保护肝脏等活性[4]。在研究内脂抗癌机制中，属结直肠癌和乳腺癌研究最多[5]。

多糖具有抗血糖[6]、降血脂[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]多种活性，徐兵[10]研究发现苦胆草多糖可以抑制视网膜母细胞增殖活性、迁移侵袭活性，并诱导肿瘤细胞凋亡。由于提取得到的多糖颜色较深，较难溶于水，且这些色素分子的存在会影响多糖发挥作用，这是因为未经处理的多糖分子量较大，体积大，且溶解后黏度大，妨碍了多糖通过机体屏障进入细胞，使其发挥不了生物学作用[11]，因此对多糖进行脱色素非常有必要。研究发现，多糖脱色素的方法常用的有树脂吸附法[12]、活性炭法[13]、双氧水法[14]等。活性炭作为一种吸附剂，是一种物理吸附法，其比表面积大、吸附性强、理化性质稳定、耐酸碱、内部空间发达[15]等独特的优势使其脱色素迅速又方便。苦胆草活性炭脱色暂无相关研究，故本研究将用活性炭进行多糖脱色，从单因素试验方面，考察其脱色率和多糖保留率，选取最优试验条件进行三因素三水平的Box-Behnken 设计试验，并通过综合评分，响应面分析法设计出最优脱色方案。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

苦胆草购于云南省大理市剑川县农贸市场；活性炭购于上海化学试剂采购供应站经销；蒽酮、浓硫酸、无水葡萄糖标准品均为国产分析纯。

1.2 主要仪器和设备

THZ-82恒温振荡器（常州智博瑞仪器制造有限公司），DL-8000C低俗冷冻离心机（上海安亭科学仪器公司），722E型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1苦胆草多糖的提取参照李月等[16]的方法。

1.3.2葡萄糖标准曲线的制作采用蒽酮浓硫酸法[17]。准确配制1 mg/mL 的标准储备液，即称取葡萄糖标准品粉末100 mg 加水定容至100 mL 的容量瓶中，取溶液配制成0.1 mg/mL 的标准葡萄糖溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 标准液带塞试管，蒸馏水补足至2 mL，在冰水浴中分别加入4 mL 0.5%的蒽酮浓硫酸试剂，试剂现配现用，避光保存于棕色瓶中。在水浴锅90 ℃以上中沸腾10 min后，取出迅速冷却，在常温放置10 min。在620 nm处进行多糖吸光度的测量。

1.3.3单因素试验取质量浓度为0.65 mg/mL的苦胆草多糖，离心取上清。在活性炭用量为0.3 g/30 mL、时间为40 min、温度为50 ℃、震荡频率为120 r/min的基础条件下，分别考察活性炭的脱色效果以及多糖保留的情况，每组试验重复3次及以上。

1.3.4响应面试验设计根据单因素试验结果，在最优试验条件下作为中心点设计Box-Behnken三因素三水平表（见表1），进一步研究活性炭用量（A）、脱色温度（B）、脱色时间（C）之间的交互影响。使用Design-Expert 8.0 设计软件优化设计多糖脱色工艺，以综合评分（Y）为响应值评价多糖的脱色效果以及多糖保留率情况，并计算出最优的试验条件。

表1 Box-Behnken试验设计

1.3.5验证试验根据响应面得出的最优脱色工艺组合进行3 次平行试验，以综合评分为指标验证响应面试验数据是否可靠。

1.3.6脱色率、多糖保留率和综合评分的测定和计算方法

（1）脱色率测定 将多糖溶液在200～1 200 nm紫外分光度计下扫描波长，结果未得到合适的最大吸收峰，根据颜色的互补定理[18]，该溶液为深褐色，选取560 nm 的波长进行后续的多糖脱色效果测定。按式（1）的计算方法计算脱色率：

（2）多糖保留率的测定 采用蒽酮浓硫酸法，在620 nm 处测定脱色前后多糖的OD 值，带入葡萄糖标准曲线的方程计算出质量浓度，按式（2）的计算方法计算多糖保留率：

（3）综合评分 综合评分（Y）= 0.5 ×

1.4 数据统计与分析

采用Origin 9.0、Excel 2007、Design-Expert 8.0软件对数据进行统计分析、绘图。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

如图1所示，以葡萄糖质量浓度（ug/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y= 0.012 9x-0.021 9，R2=0.993 9，表明10～60 ug/mL 范围内的葡萄糖标准质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1活性炭用量在基础条件下，分别考察活性炭用量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 g/30 mL 的多糖脱色率与多糖保留率。如图2 所示，在0.3 g/30 mL 用量之前，随着活性炭用量的增加，脱色率呈陡峭曲线上升，表明在此范围内，脱色率与活性炭使用量成正比关系；而在活性炭添加量0.3 g/30 mL 之后，脱色率曲线较之前曲线平缓，表明脱色效果在下降，这可能是随着活性炭添加量的增加，活性炭逐渐与溶液中的色素分子的结合，呈饱和状态；多糖分子随着活性炭添加用量的增加不断减少（图3），这可能是由于活性炭的吸附为不定向，在吸附色素分子的同时也吸附了多糖分子。由此表明，活性炭取量在0.3 g/30 mL 时脱色效果和多糖保留率都处于良好状态，故选择用量0.3 g/30 mL为响应面活性炭用量的中心点。

图2 活性炭用量对多糖脱色率与多糖保留率的影响

图3 活性炭用量对苦胆草多糖综合评分的影响

2.2.2脱色时间在设置的基础条件下，分别考察脱色时间20、30、40、50、70 min 的多糖脱色率与多糖保留率。由图4、图5 可知，随着时间的增加，脱色率不断增加，多糖保留率不断下降。随着时间的增加，脱色率上升的并不多，即在68%～76%，这表明活性炭脱色效果与时间的关系不是很大，随着时间的增加，活性炭所吸附的分子越来越多，当基本填满作用孔径时，每个活性炭表面都吸附色素分子，空间变得拥挤、堵塞，造成吸附色素分子的能力下降，称为“堵车”现象。为节省时间以及减少多糖分子不必要的损失，故选择40 min 作为响应面脱色时间的中心点。

图4 脱色时间对多糖脱色率与多糖保留率的影响

图5 脱色时间对苦胆草多糖综合评分的影响

2.2.3脱色温度在基础条件下，分别考察脱色温度30～70 ℃条件下的多糖脱色率和多糖保留率。如图6、图7所示，随着脱色温度的上升，脱色率不断上升，基本与脱色温度成正比关系，在70 ℃时，曲线变得较平直，这说明一定的温度可以促进活性炭的吸附，但是活性炭会处于空间饱和状态，所以过高的温度对多糖脱色效果不明显，只会更多地损耗多糖。从多糖保留率来看，随着温度的上升，多糖保留率不断下降，由图6 可知，为更多地保留多糖分子，因其多糖保留率40 ℃后出现骤减，故选择40 ℃作为响应面脱色温度的中心点。

图6 脱色温度对多糖脱色率与多糖保留率的影响

图7 脱色温度对苦胆草多糖综合评分的影响

2.3 响应面试验设计结果

响应面试验设计结果与方差分析表见表2、表3。由表2 数据得出二次回归模型方程，Y=+69.25+3.52A+1.19B+0.44C+0.093AB+0.039AC+0.22BC-1.99A2+0.060B2+0.77C2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 回归模型的方差分析

其中Y（综合评分），A（活性炭使用量），B（脱色时间），C（脱色温度）。

2.4 验证试验结果

以综合评分为指标，并通过回归二次方程得出的最佳脱色工艺组合为活性炭用量0.4 g/30 mL、温度45.23 ℃、时间49.92 min，综合评分预测值为72.828 5，保留2位小数约72.83。

考虑到试验的条件，最终验证试验条件改为用量0.4 g/30 mL，温度45.20 ℃，时间50 min。在其他条件不变的情况下，试验重复3次取均值，在此条件下多糖脱色率为80.49%，多糖保留率65.34%，综合评分为72.91，与预测值的综合评分72.83相差很小，相对误差为0.11%。这表明该模型下提供的最优工艺参数具有可靠性，可应用到实际中。

3 结论

本文以活性炭对多糖进行脱色试验，选取单因素试验结果最佳试验范围，后通过响应面试验设计，以综合评分为指标筛选出了最优脱色工艺条件：活性炭用量0.4 g/30 mL、温度45.2 ℃、时间50 min，在此条件下，多糖平均脱色率为80.49%，多糖保留率65.34%，综合评分为72.91，接近预测值72.83。表明该工艺设计的条件以及得出的结果具有可靠性、精确性，可应用到实际工作中去，避免在实际工作中造成资源、成本的浪费。

活性炭在日常生活中具有脱色、净化污水、吸附有毒气体、净化空气等诸多作用，在多糖脱色这一块，相校其他方法如过氧化氢法、大孔树脂吸附法，具有成本低廉、脱色效率高、所耗时间短以及不改变多糖的性质、也不带进别的物质的优点，非常适合工艺化的生产需求。不过活性炭也有不足的地方，活性炭的吸附不具有特定性，它没有选择性地吸附所有可吸附的东西，所以在多糖脱色时也会造成多糖的损耗，并且它本身是黑色粉末状，自带黑色物质，在脱色时，需要不断离心、过滤才能清除黑色物质，在此过程中造成时间成本增加，试验也变得繁琐，故今后对活性炭的研究可以关注如何快速地除去活性炭本身的颜色以及控制活性炭在吸附色素时不吸附多糖分子。