基于代谢组检测的草莓果实香气物质的比较分析

冯 佳， 李 莉，范婧芳， 张建军，杨 雷*，杨 莉*

（1.河北省农林科学院 石家庄果树研究所，河北 石家庄 050061；2.河北省植保植检总站，河北 石家庄 050035；3.河北省农林科学院，河北 石家庄 050051）

0 引言

水果的香气是通过嗅闻感受到的挥发性物质，可以客观地反映果品的成熟度、风味等品质，在吸引消费者和增强果品市场竞争力方面发挥了重要作用。草莓果实风味独特，被认为是香气物质种类最丰富的水果之一［1-2］。虽然草莓鲜果重中的挥发性物质含量占比仅为0.001%～0.01%，但对草莓香气的形成有极重要的作用［3］。目前，草莓果实中已被鉴定到的挥发性代谢物有千余种［4］。Zhang等［5-9］研究发现，在大部分草莓品种中，酯类挥发性化合物的种类最为丰富、含量也最多，其次为醇类和醛类，另外还包括酮类、酸类、酚类、烷烃等。这些挥发性代谢物气味各异，在草莓果实中通过协同或拮抗的相互作用，最终形成独特的香气。

影响草莓香气的因素有很多，主要包括品种、光照、温度、水肥、管理方式等［10-15］。不同的草莓品种表现出不同的香气，例如京桃香具有特别浓的桃香味，源于京桃香中γ-癸内酯的浓度最高；而白雪公主的菠萝香气则由其特有物质2-甲基丁酸甲酯以及特征香气物质丁酸甲酯、乙酸苄酯、丁酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、(E)-2-己烯醛、DMMF等共同作用形成［16］；通过研究红颜不同发育时期的果实挥发性代谢物，推测出呋喃酮和己烯醛是红颜果实的特征香气物质［17］。光照对草莓香气的形成有重要作用，通过遮阴处理，即光照强度减弱时，草莓的香气物质种类明显增加［18］；而用不同颜色的塑料薄膜对草莓进行遮盖处理时，主要有透明、红色、黄色、绿色、蓝色和紫色等6种处理，结果显示，经过红膜遮盖处理过的草莓果实中挥发性代谢物种类最多，其香气浓度显著增加［19-20］。科学的水肥管理、植株管理等措施也会促进草莓香气的形成［21］。氮素营养可以影响草莓香气物质的形成，在增加氮素的施加量以后，草莓中的一些香气物质成分含量呈先上升后下降的变化趋势，因此合理施用氮肥可以增加草莓的香气浓度［22-23］。疏叶疏果等植株管理措施对草莓果实香气物质的形成也有一定的影响。摘除叶子的同时会提高果实中酸类、醛类等物质的含量，而酯类和DMMF等一些主要香气物质的相对含量会显著下降，致使果实的香气变淡；而随着疏果的进行，主要香气物质的含量会呈现上升趋势，果实的香气也会更加浓郁［24-25］。倪溢楠［26］将16种草莓果实的特征香气成分分为5种类型：菠萝香、果香、柑橘香、桃香和花香。付磊等［13］研究发现，青草香主要来源于醇类物质和醛类物质，也有研究表明果香味和花香味受到酯类和内酯类物质的影响，呋喃类物质则会形成焦糖味，玫瑰香味来源于沉香醇和DMMF等［27-29］。

本文选取冀香、冀九、红颜3个香气迥异的草莓品种作为研究对象，检测草莓果实在不同发育时期的挥发性物质代谢谱，结合对3个品种的感官评价，以期探究影响草莓果实独特香气的关键物质，为开展草莓果实香气的后续研究、筛选优质草莓品种等提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于河北省农林科学院石家庄果树研究所展开。选取的草莓品种包括：河北省石家庄果树研究所自育优良品种冀香(JX)和冀九(JJ)以及本地栽培面积较为广泛的日本品种红颜(HY)。以上3个品种均栽植于河北省农林科学院石家庄果树研究所草莓试验基地日光温室，统一进行常规的田间管理。采样果实均为大小一致的二级果，摘取不同发育时期的新鲜果实后，立即进行液氮速冻，保存于-80 ℃的超低温冰箱。每个样品5个果实，每个品种3个重复。

1.2 草莓香气风味的感官评价方法

按照《感官分析方法风味剖面检验》 (GB/T 12313—1990)的方法，从石家庄铁道大学中选15名在读本科生（7男8女）组成评价小组，进行香味感官描述词的描绘统计。具体流程为：将成熟度相同且具有品质属性代表性的草莓果实提供给评价员，每个品种提供3个果实；要求评价员进行嗅闻并对样品的香气尽可能多地选取词汇进行描述；统计评价员对草莓果实香气的描述词汇，去除低频词汇和不准确词汇，最终得到3个草莓品种的果实香气描述词汇。

获得描述词汇后，对草莓果实香气进行感官评价。将3个不同品种的草莓果实样品随机提供给15位评价员，要求评价员对各香气属性的强度进行评分。采用定量评分法进行评分（5分：香气特浓；4分：香气较浓；3分：有香气；2分：香气较淡；1分：几乎没有香气）。每轮评价完成后休息3 min，提供纯净水消除残留余味和感官疲劳。

1.3 挥发性代谢物的测定方法

1.3.1 样品提取 从-80 ℃冰箱中取出样品进行液氮研磨，涡旋混合均匀，每个样本称取约1 g（液体1 mL)于顶空瓶中；分别加入饱和NaCl溶液、10 μL（浓度为50 μg/mL)内标溶液；采用全自动顶空固相微萃取(HS-SPME)进行样本萃取，以供GC-MS分析。

1.3.2 色谱质谱采集 HS-SPME 萃取条件：在60 ℃恒温条件下，震荡5 min，120 μm的DVB/CWR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶，顶空萃取15 min，于250 ℃高温下解析5 min，然后进行GC-MS分离鉴定。采样前萃取头在250 ℃ Fiber Conditioning Station 中老化5 min。新萃取头萃取前先在Fiber Conditioning Station中老化2 h；并且采用的是SPME Arrow，其灵敏度可达传统SPME纤维头的10倍。

色谱条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, USA)，载气为高纯氦气（纯度不小于99.999%），恒流流速为1.2 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流进样，溶剂延迟3.5 min。程序升温：40 ℃保持3.5 min，以10℃/min的加热速度升至100 ℃，再以7 ℃/min升至180 ℃，最后以25 ℃/min升至280 ℃并保持5 min。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质谱接口温度280℃，电子能量70 eV，扫描方式为选择离子检测模式(SIM)、定性定量离子精准扫描(GB 23200.8—2016）。

1.4 数据处理

通过软件Qualitative Analysis Workflows B.08.00打开浏览质谱分析后的下机原始数据，并用于定性分析。采用MassHunter定量软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作。

2 结果与分析

2.1 3种草莓果实香气的感官评价

选取15人组成评价小组，对冀九、冀香、红颜果实的香气进行评价，统计结果后绘制成雷达图（图1）。结果显示，冀九、冀香、红颜3个品种的草莓果实风味各异，香气浓郁。冀九的得分为花香5分，果香5分，甜香3分；红颜表现为花香5分，还具有较浓的脂香和甜香，得分均为4分，果香3分。冀九和红颜的香气类型较为接近，且均是花香较为突出；冀香的香气种类主要为果香、花香和青香，其中得分最高的是果香，为5分，花香和青香均为4分，酸香3分。因此，可将这3个品种初步分为2个类别：香甜浓郁、花香四溢的冀九和红颜，果香浓郁且酸甜爽口的冀香。

图1 3个品种草莓果实香气的感官评价图

2.2 3种草莓果实的挥发性代谢物分析

冀九、冀香、红颜这3个品种的草莓果实表现出不同的香气风味。为了进一步分析草莓果实形成不同香气的原因，分别取各品种绿果期（授粉后13～15 d，G)、白果期（授粉后19～21 d，W)、转色期（授粉后24～26 d，T)和成熟期（授粉后33～35 d，R)。通过挥发性代谢组共检测到674种代谢物。从物质种类上看，萜类物质种类最多，有137种，其次为酯类物质，有116种，另外还包括杂环化合物、醇类、酮类、芳烃类、醛类、酚类、酸类等物质（图2）。

图2 3种草莓果实中挥发性代谢物质的种类占比图

获得代谢组结果后进行了主成分分析，以便初步了解各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。由图3可知，各样本的3个生物学重复较好地聚集在一起，表明样本的重复性较好。3个品种绿果期、白果期和转色期的样本较为聚集，与成熟期的样本分散开来，表明在未成熟的果实中，不同品种间不同时期的代谢物差异相对较小，而到了成熟期，挥发性代谢物含量发生较大变化。在成熟期的果实样本中，红颜和冀九较为聚集，表明这2个品种成熟果实间的挥发性代谢物种类较为相近，而与冀香相距较远，其挥发性代谢物差异较大，这一结果很好地验证了感官评价的结果。

图3 3种草莓果实样本间的PCA分析

2.3 3种草莓果实不同发育时期代谢物的差异分析

随着草莓果实的逐渐成熟，果实的香气愈加浓郁。从热图分析结果来看(图4），随着3个品种果实的成熟，大部分代谢物的含量逐渐增多。火山图（图5）显示了3个品种不同时期代谢物质的差异。由图5可知，冀香白果期有84种挥发性代谢物，含量与绿果期相比差异显著，其中的60种物质含量上升，24种物质含量下降；冀香转色期的挥发性代谢物含量相较于其白果期，有61种物质含量显著上升，没有显著下调的物质；冀香成熟期的挥发性代谢物含量相较于其转色期，有277种物质含量发生显著变化，其中有233种物质含量显著上调。红颜和冀九在不同时期果实中代谢物含量的变化规律与冀香表现一致，从绿果期到转色期含量差异显著的挥发性代谢物种类较少，而从转色期到成熟期，含量发生显著变化的种类急剧上升，且大多数物质的含量显著上调，这表明从转色期到成熟期，草莓果实中的香气物质迅速且大量地积累，此为香气形成的关键时期。在从转色期到成熟期显著上调的挥发性物质中，萜类和酯类物质种类最多，例如在冀香果实中（表1），萜类物质有61种，占总上调物质种类的27.6%，酯类物质有53种，占总上调物质的23.9%，综上表明酯类物质和萜类物质是草莓果实香气形成的关键物质。

表1 3种草莓果实成熟期显著上调物质的种类及数量

图4 3个品种草莓果实不同发育时期的挥发性代谢物含量

图5 3个草莓果实品种不同发育时期差异代谢物火山图

鉴于成熟期是草莓果实香气形成的关键时期，本文着重分析了3种草莓果实从转色期到成熟期的物质变化情况。由图6a可知，在冀香中，上调最明显的物质分别为反式-1-硝基-1-丙烯、(1S，4S，4αS)-1-异丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,4α、5-六氢萘、4,5-二氢-2-甲基-1H-咪唑、7,9-二甲基-十六烷等，4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛、(Z，E)-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-醇、3-羟基-2-丁酮、丁酸丁酯等物质仅在冀香中呈现差异表达； 冀九中上调最明显的物质分别为氧化石竹烯、顺-5-十二碳烯酸、(1S，4S，4αS)-1-异丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,4α、5-六氢萘、反式-β-金合欢烯、丁酸乙酯等，其中丁酸乙酯、2,5-二丁氧基-2,5-二氢呋喃、(1R，4R，4αS，8αR)-4,7-二甲基-1-（丙烯基）-1,2,3,4,4α、5, 6,8α-八氢萘等物质仅在冀九中呈现差异表达(图6b)；红颜中上调最明显的物质分别为(E)-2-己酸、(2E，4S，7E)-4-异丙基-1,7-二甲基环癸-2,7-二烯醇、氧化石竹烯、顺-5-十二碳烯酸、顺-3-己烯基苯甲酸酯等(图6c)。这些物质的大量积累对草莓果实独特香气的形成起到了关键作用。

图6 3种草莓品种果实成熟期差异（上调、下调）最显著的前10种物质

利用 K均值（K-Means）聚类分析，进一步分析了冀九、冀香、红颜3种草莓果实发育成熟进程中各种挥发性代谢物的变化趋势，将挥发性代谢物的积累情况分为了5个簇（图7）。由图7可知，簇1、簇2、簇5中的物质在冀九、冀香、红颜3种草莓果实中的变化规律基本一致。在簇5中共包含139种挥发性代谢物，这些代谢物的含量从绿果期到白果期再到转色期缓慢积累，从转色期到成熟期急剧上升，这与草莓果实香气的形成过程一致。比如，簇5中的萜类物质芳樟醇、酯类物质乙酸甲酯、酚类物质苯酚、酮类物质2,6,6-三甲基双环［3.2.0］庚-2-烯-7-酮，簇2中的醇类物质（2E，4S，7E）-4-异丙基-1,7-二甲基环癸-2,7-二烯醇、萜类物质α-石竹烯醇、酯类物质顺-3-己烯基苯甲酸酯、酮类物质2-庚酮等含量在绿果期、白果期、转色期极低，而在成熟期非常高，可猜测出这些物质对草莓果实香气的形成至关重要。簇1中的物质含量在3个草莓品种果实中的变化趋势一致，均随着果实的发育成熟呈下降的趋势，这与草莓果实中香气积累的变化过程不一致，因此簇1中的这些物质对草莓果实香气的形成影响甚微。

图7 3种草莓果实发育成熟进程中各种挥发性代谢物的K均值聚类分析

2.4 不同草莓果实品种间的差异代谢物分析

簇2和簇5中的代谢物含量随着果实的发育成熟逐渐积累，进一步分析发现，簇5中的代谢物质在冀香成熟期的积累量显著高于红颜和冀九的。其中，3-戊烯-2-醇在冀香成熟期果实中的相对含量最高，分别是红颜和冀九成熟期果实中的3倍和7.4倍。其次分别是萜类芳樟醇、酯类乙酸甲酯、含氮物质反式-1-硝基-1-丙烯、酚类物质苯酚。同样的设置条件下，冀香果实成熟期的挥发性代谢物含量是红颜、冀九的2倍，通过筛选共获得56种物质，其中萜类物质14种，酯类物质12种，杂环化合物12种(图8a)。3-戊烯-2-醇、反式-1-硝基-1-丙烯、4,5,6,7-四氢-3,6-二甲基-苯并呋喃、(R)-(-)-香芹酮、乙酸对甲酚酯这5种物质的相对含量较高，2-（1-甲基丙基）-苯酚、2,3-二甲基-三环［2.2.1.0（2,6）］庚烷-3-甲醇这2种物质仅在冀香中大量积累。结合冀香的独特香气，可推测这些物质对果香、青香和酸香的形成较为关键。

图8 3种草莓品种果实成熟期不同香气物质统计

冀九表现出浓烈的花香和淡淡的果香、甜香、脂香，并且冀九中含量较高的物质主要集中在簇2中。冀九中含量最高的是醇类：(2E，4S，7E)-4-异丙基-1,7-二甲基环癸-2,7-二烯醇，其次为酯类：丁酸辛酯、萜类α-石竹烯醇和氧化石竹烯、酸类顺-5-十二碳烯酸、酯类3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯。同样的设置条件下，冀久果实成熟期的挥发性代谢物含量是红颜、冀香的2倍，共得到90种物质，种类最多的为萜类28种，其次是酯类25种(图8b)。在这些物质中，含量最高的是（2E，4S，7E）-4-异丙基-1,7-二甲基环癸-2,7-二烯醇，分别是冀香、红颜中的2.61倍、3.06倍。另外，乙酸癸酯、α-石竹烯醇、氧化石竹烯、十三烷醛、3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯等物质在冀九中含量也非常高。己二酸二乙酯、2,2′-异亚丙基双（5-甲基呋喃）这2种物质仅在冀九中大量积累。以上这些物质可能对冀九香气的形成有重要贡献。

红颜的果实香气与冀九更为相近，与冀香相比，红颜的甜香、脂香、花香香型较为突出，因此挑选了在冀九和红颜的成熟果实中积累较多而在冀香中含量较少的物质(图8c)。共48种物质，其中酯类物质14种，萜类物质7种，芳烃类物质6种。这些物质分布于除簇5以外的其他分组，簇2中有24种，簇4中有17种。酮类物质异佛尔酮、4′-羟基-3′-甲氧基苯乙酮含量最高，其次为萜类物质（2S，3S，6S）-6-取代基-3-甲基-2-（丙烯基）-3-甲苯环己酮、［1S-(1α，4β，5α)］-1,8-二甲基-4-（1-甲基甲苯）-螺环［4.5］癸烯、α-法呢烯等。这些物质可能对甜香、脂香、花香的香型形成贡献较大。

3 讨论

果实香气是影响消费者偏好和购买欲的重要品质。果实中挥发性物质的种类和含量是果实香气形成的关键因素。本研究利用挥发性物质代谢组检测获得了冀香、冀九和红颜3个不同草莓品种在不同发育时期的挥发性物质代谢谱，并结合果实香气的感官评价展开了分析。基于15人感官评价小组的感官评价结果，冀香的主要香气类型为果香、酸香和青香，而冀九与红颜的香气类型较为接近，主要为花香、甜香和脂香。不同研究对相同草莓品种香气类型的划分存在一定的差异。王娟等［16］的研究表明，红颜的主要香型为花香，与本研究结果较为一致；倪溢楠［26］的研究结果表明，红颜的主要香型为果香，与本文研究结果不一致，这可能与研究方法、栽培环境等因素的差异有关。

笔者采用挥发性代谢组手段共检测到674种挥发性代谢产物，数目上显著高于以往的研究［12,16］，体现出了代谢组学的优越性。其中，萜类物质最多，其次为酯类物质、杂环化合物、酮类、醇类、醛类等，相较于前人的研究，萜类物质、杂环化合物的种类数量明显提高。冀香、冀九和红颜这3种草莓果实中的挥发性代谢物均在果实成熟期时大量积累，表明成熟期是草莓果实香气形成的关键时期。王娟等［16,29］研究表明，在草莓果实中，酯类物质的种类和含量最丰富，是形成草莓香气的主要物质。本研究结果显示，在草莓果实成熟期，萜类和酯类物质的上调积累最显著，因此，研究认为除了酯类物质外，萜类物质对草莓香气的形成也有较大作用。

基于成熟期是草莓香气形成的关键时期，本研究着重对比了3个草莓品种果实转色期与成熟期挥发性代谢产物的差异。其中，(2E，4S，7E)-4-异丙基-1,7-二甲基环癸-2,7-二烯醇、丁酸辛酯、α-石竹烯醇、氧化石竹烯、3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯等物质在3个草莓品种成熟期的果实中含量都非常高，表明这些物质是草莓香气形成的关键物质。一些酯类物质可以使草莓散发果香味，如丁酸乙酯、乙酸甲酯、己酸乙酯这3种物质具有菠萝香味，丁酸甲酯具有苹果香味等。在冀香、冀九和红颜中，乙酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸辛酯、己酸甲酯、辛酸丁酯、丁酸丁酯、戊酸芳樟酯、异丁酸香叶酯等多种酯类物质大量积累，形成了这3个品种的草莓果实果香味，并且这些物质在冀香和冀九中的含量是红颜的2倍以上，因此在感官评价结果中，冀香和冀九的果香味比红颜的更浓一些。芳樟醇表现为花香味，在冀香和红颜中含量均非常高，且成熟期含量极显著高于转色期，但是在冀九中并没有检测到芳樟醇，表明芳樟醇是冀香和红颜花香的主要成分，而冀九的花香则来源于其他物质，比如萜类物质α-石竹烯醇等。

利用K均值（K-Means）聚类分析将挥发性代谢物分为5类，簇1中的物质含量在3个品种中随着果实的成熟均呈下降趋势，这与草莓果实香气的形成趋势相反，表明这些物质不参与最终果实香气的形成。簇2中的物质随着果实的成熟逐渐积累，并且这些物质在冀九中的含量显著高于冀香和红颜。例如己二酸二乙酯、2,2′-异亚丙基双（5-甲基呋喃）这2种物质仅在冀九中大量积累，（2E，4S，7E）-4-异丙基-1,7-二甲基环癸-2,7-二烯醇、乙酸癸酯、α-石竹烯醇、氧化石竹烯、十三烷醛、3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯等物质在冀九中的含量是冀香和红颜的2倍以上，因此可认为簇2中的物质对冀九香气的形成有较大贡献。同样，簇5中的物质在冀香果实成熟期的积累量显著高于冀九和红颜的，这些属于冀香独特的香气物质，即对果香、青香和酸香的形成十分重要。簇3中的香气物质含量在冀九和冀香中均呈现先上升后下降的变化趋势，但在红颜中随着果实的成熟逐渐积累，猜测这些物质对红颜香气的形成有重要贡献。而簇4中的物质仅在冀九和红颜中随着果实的成熟逐渐积累，是冀九和红颜香气成分的共有物质，即对花香、甜香和脂香的形成较为重要。

4 结论

利用代谢组共检测到674种挥发性代谢物，其中萜类物质和酯类物质的种类最多，是影响草莓香气形成最重要的2类物质。簇5中发现有3-戊烯-2-醇、芳樟醇、乙酸甲酯等139种物质在冀香果实成熟期时大量积累，对冀香果实中果香、青香和酸香的形成较为关键；冀九果实表现出浓烈的花香和淡淡的果香、甜香、脂香，发现有194种物质（簇2）在冀九果实中大量积累，包括己二酸二乙酯、2,2′-异亚丙基双（5-甲基呋喃）等，对冀九香气的形成极为重要；而簇3中有73种物质在红颜香气的形成过程中发挥了重要作用。