辣椒疫病研究进展

雷 刚，周坤华，陈学军，黄月琴，袁欣捷，李歌歌，谢媛媛，方 荣

（江西省农业科学院 蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330200）

0 引言

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsiciL.)侵染引起的一种土传性病害，其会严重影响辣椒产量［1-2］。自1922年首次报道以来，辣椒疫病就成为制约辣椒生产的一种全球性毁灭性病害［3-4］，每年在全球造成的损失达100万美元［5］。辣椒疫病在我国各地均有大面积发生，尤其南方地区高温高湿环境下，病害更容易暴发，且危害更为严重［1，6］。辣椒疫霉菌宿主广泛，可经由土壤传播，具有无性和有性繁殖等特性，这使得通过改变栽培方式、使用化学药剂等措施的防效甚微［3，7-8］。因此，提高辣椒对疫病抗性的遗传改良，筛选和培育抗病品种是抵御病害最经济有效的方式［9］。然而，辣椒对疫病抗性的遗传复杂，互作机制尚不明晰，导致广谱抗性的品种不多，因此对辣椒—辣椒疫霉互作的分子机制解析成为本阶段研究的重点。本文就辣椒疫病基本情况、疫霉菌致病性和辣椒疫病抗性的研究进展进行综述，为进一步解析其互作的分子机制提供理论参考。

1 辣椒疫病概述

1.1 辣椒疫霉菌的生活特性

辣椒疫霉菌属于卵菌纲疫霉属(Phytophthora)，是一种独特的类真菌真核微生物，卵菌类植物病原体表现出活体营养性、死体营养性或两者结合的半活体营养性的生活方式，其中辣椒疫霉是以半活体营养形式生活［10］。辣椒疫霉能够通过有性和无性方式进行繁殖。因辣椒疫霉属于雌雄异体，当2种交配型A1和A2相互接触时，病原体可以进行有性繁殖，产生厚壁卵孢子，这些卵孢子能够在土壤中存活数年，并在有利的环境条件下发芽［11-12］；辣椒疫霉病原体在有利条件环境下则通过无性繁殖产生大量的无性孢子囊，其直接发芽或释放游动孢子感染宿主［13-14］。在我国，辣椒疫霉病原体的无性繁殖在中部地区占主导地位，而在北方和南方地区以有性繁殖为主［15］。此外，辣椒疫霉菌宿主广泛，除了能以葫芦科［16-20］、茄科［2，21-22］、豆科［23-24］等作物作为宿主，甚至还能侵染木本植物［25-27］等70多种植物［28］，是迄今为止宿主范围最广的病原菌［29］。辣椒疫霉菌的这些特性为其生存和快速繁殖提供了条件，同时也给疫病的防控带来了巨大挑战。

1.2 辣椒疫病发病症状

辣椒疫霉不仅能侵染辣椒植株的根和茎，引起根、茎腐烂，还能危害叶和果实，导致叶和果实枯萎［30］。辣椒疫霉侵染引起的根腐主要表现为根系变暗，出现小病斑，并迅速扩展到整个根系和茎部，最终导致整个植株萎蔫、死亡，这是辣椒生产中最具破坏性的病害［31］；茎枯则表现为侵染点出现褐色或棕色病斑，随后蔓延并包围茎导致茎或整株枯萎、死亡［2］；叶枯主要表现为侵染点出现圆形或不规则形状的似“水浸”的病斑，叶色变深，随后病斑开始扩大，并变成干燥、褐色，最终蔓延至茎部，并伴随病叶脱落［31-32］；辣椒果实发病多从果蒂或果尖处开始向另一端蔓延，病斑起初为不规则的水渍状，很快扩展至整个果实［33］，导致果实变褐，果肉软腐，随后果实感染组织失水、干缩变成黄褐色或浅棕色。

1.3 辣椒疫病主要防控手段

高温高湿环境有利于辣椒疫霉菌的传播［12，34］，长期湿度饱和适宜温度的土壤有利于疫霉菌侵染引起的根腐病的发生［31］；疫霉菌侵染导致的叶枯病和茎枯病多发生在相对空气湿度高的地区和春、秋季多雨的时期，降雨和不科学的灌溉可能是使病原菌从土壤中传播到地上部分的重要媒介［12，35-36］。在生产实践中，首先可通过合理灌溉、合理密植、轮作、土壤消毒、烟熏等来限制病原菌的传播，创造不适宜病原菌生长的环境［29］；其次，喷施化学杀菌剂，如苯酰菌胺、甲霜灵、烯酰吗啉等为目前辣椒疫霉菌防治的重要手段；再次，培育抗性品种被认为是抵御病害最经济有效的方式［9］，然而当前的一些抗疫病品种是对某一地区或特定生理小种的抗性，且由于商业品种的单一化种植和病原菌新毒性基因的产生等原因，往往会导致品种抗病性的丧失［37］。因此，深入研究辣椒疫病抗原，培育广谱抗性的新品种是疫病防控的重要方向。

2 辣椒疫霉菌致病机制

2.1 基于效应子的致病机制

效应子(effectors)是由病原菌分泌以操纵宿主细胞结构和功能，从而促进感染和/或触发防御反应的病原体分子［38］。当植物遭遇病原菌侵染后，先通过识别病原体相关分子模式(Pathogen/microbeassociated molecular patterns，PAMPs/MAMPs)引起模式触发的免疫(Pattern-triggered immunity，PTI)，进而引发过敏性细胞坏死和防御反应；但疫霉菌已经进化出可以镇压或逃避PTI的效应子，而植物则利用抗病基因产物来识别效应子以激活效应子触发的免疫响应(Effector-triggered immunity，ETI)，引发过敏反应和相关防御响应。参考文献［39-56］可知，效应子按作用部位分为质外体效应子和细胞质效应子，其作用机制和功能也不尽相同，近年来鉴定的辣椒疫霉菌效应因子及其功能见表1。

表1 辣椒疫霉菌效应子及其功能

2.1.1 质外体效应子 质外体效应子主要包含细胞外毒素、水解酶和抑制剂等，其中有关细胞外毒素，如坏死和乙烯诱导肽类似蛋白(Necrosis and ethylene inducing peptide-like proteins，NLPs)家族和富含半胱氨酸小分子(Small cysteine-rich，SCR)蛋白家族在辣椒疫霉中研究较多。phcnlp1属于辣椒疫霉NLPs蛋白家族基因，在疫霉菌侵染后的症状发展过程中表达增加，引起烟草植株明显的坏死［39］。Feng等［40］利用qRT-PCR方法检测了P. capsici感染后11个PcNLP基因在不同时间点的表达谱，发现PcNLP2、PcNLP6和PcNLP14在侵染过程中表达量最高，且在辣椒和烟草中引起最大的黄化或坏死区域，表明其在P. capsici侵染过程中的强毒力。随后，通过对辣椒疫霉NLP基因家族进行分析，Chen等［41］鉴定了辣椒疫霉的65个NLPs基因，其中Pc11951、Pc107869、Pc109174和Pc118548编码蛋白能够诱导辣椒和烟草植株细胞死亡。SCR蛋白家族在病原体—植物互作中发挥重要作用。辣椒疫霉scr82基因在菌丝体、孢子囊和游动孢子阶段表达微弱，但在感染开始时迅速上调，其过表达增加了病原体的毒力和对氧化应激的耐受性，而scr82敲除导致P. capsici的毒力严重受损和抗氧化应激能力显著降低［42］。此外，激发素(Elicitins)是一种结构相关的细胞外蛋白家族，在烟草中诱导过敏性细胞死亡和产生其他防御相关的生化变化［43］。辣椒疫霉编码激发素的基因PcINF1瞬时过表达触发辣椒细胞死亡，同时伴随过敏反应诱导基因1(HIR1)和发病相关基因的表达；进一步研究发现，其表达产物PcINF1与辣椒SRC2-1构成的膜靶向复合物PcINF1-SRC2-1是触发细胞死亡所必需的［44］。含CBM1结构域蛋白(CBPs)在植物—微生物相互作用中起着关键作用，被植物识别为微生物相关分子模式(MAMPs)。辣椒疫霉PcCBP3是一个质外体效应子，参与诱导油菜素类固醇不敏感相关受体激酶1(BAK1)依赖的细胞死亡过程［45］。

2.1.2 细胞质效应子 由疫霉菌分泌后转移至宿主细胞内发挥作用，主要包含RxLR和皱缩坏死蛋白(crinkling and necrosis，CRN)效应子［46］。RxLP效应子因包含1个保守的氨基酸基序(Arg-Xaa-Leu-Arg)，即RxLR基序而得名，辣椒疫霉菌基因组编码400个RxLR效应子［47］，其通常与宿主细胞中的靶向基因互作，通过行使以下3个方面的功能增加其致病能力：(1)镇压宿主免疫响应。辣椒疫霉菌效应子RXLR242能够通过靶向宿主多个RAB(Rasassociated binding)蛋白，如RXLR242与RABE1-7的竞争性相互作用抑制了囊泡相关蛋白复合物的形成和病程相关蛋白1(Pathogenesis-related protein 1，PR1)的合成，其次RXLR242还竞争性地靶向RABA4-3蛋白干扰膜受体FLS2(flagellin-Sensing)的转运，进而影响宿主的免疫响应［48］。RXLR25效应子则直接靶向宿主细胞质类受体激酶亚家族Ⅶ(Receptor-like cytoplasmic kinase subfamily Ⅶ，RLCK-Ⅶ)蛋白，抑制模式诱导的RLCK-Ⅶ磷酸化以镇压下游免疫反应［49］。辣椒疫霉菌的RxLR效应子PcAvh103通过靶向宿主EDS1(Enhanced Disease Susceptibility 1)破坏EDS1-PAD4(Phytoalexin Deficient 4)复合体，进而抑制植物的免疫响应［50］。(2)增加宿主对病原菌的敏感性。辣椒疫霉RxLR效应子PcAvr3a12在侵染期与包含肽基脯氨酸顺反异构酶(PPIase)活性的FKBP15-2互作，抑制其免疫响应活性，增加植物对病原菌的敏感性［51］。辣椒疫霉RxLR效应子PcAvh1与调控植物免疫和生长的蛋白磷酸酯酶2A亚基(PP2Aa)互作而促进病原菌的侵染［52］。(3)诱导宿主细胞死亡。拟南芥ACD11与BPA1及其同源物互作，在ROS稳态和防御反应中发挥重要作用。研究表明辣椒疫霉效应子RxLR207可促进BPA1、BPL1、BPL2和BPL4的降解，以26S蛋白酶体依赖的方式破坏ACD11的稳定性，从而激活ROS介导的细胞死亡［53］。

细胞质内另一类效应子CRN以宿主细胞核为靶点，通过抑制相关基因的表达来影响宿主免疫响应［46］。辣椒疫霉CRN效应子PcCRN4由质外体转运至宿主细胞核，并通过抑制宿主病程相关基因的表达镇压其抗性，通过操纵细胞死亡相关基因的表达诱导宿主细胞死亡［54］。在植物中过表达效应子蛋白基因PcCRN83_152引起宿主细胞死亡，同时增强病原菌的毒力，进一步研究发现其毒性功能和诱导细胞死亡是独立的［55］。

2.2 其他与致病相关的因子

大量分泌效应物是植物病原体致病性的一个重要方面［57］，然而部分与疫霉菌生长、发育相关的因子也被报道影响其毒力和致病性［58］。辣椒疫霉PcAPT1参与调控菌丝生长、磷脂酰丝氨酸的跨膜转运及水解酶分泌，其敲除菌株表现出明显降低的致病力［58］。与之相似的是，高亲和性磷酸二酯酶PcPdeH、疫霉菌纤维素合酶PcCesA1、PcLRR-RK1和几丁质合酶PcCHS也被报道参与辣椒疫霉菌营养生长、孢子萌发和发育过程，同时对致病性至关重要［59-62］。此外，辣椒疫霉果胶裂解酶基因PcPL1、PcPL15、PcPL16和PcPL20表达产物可以增加病原菌毒力，促进其侵染和诱导宿主细胞死亡［63］，而果胶甲酯酶PCPME6通过降解宿主细胞壁来促进病原菌侵染，最终导致坏死病斑的产生［64］。辣椒疫霉菌PcFtsZ2蛋白是其无性繁殖和侵染宿主所必需的，PcFtsZ2基因沉默抑制了侵袭性结构的生长和发育，极大地抑制了病斑的发展［65］。转录调节因子PcNmrAL1被报道与生物营养标记基因PcHmp1(吸器膜蛋白1)共表达，除了控制转录、翻译和氮代谢的因素外，还有助于调节病原菌中大量效应因子基因的表达，介导生物营养向坏死营养的转变，驱动作物疫霉病周期［66］。编码多肽的小开放阅读框(Small open reading frame-encoded polypeptides，SEPs)参与生命体对环境的响应，在辣椒疫霉菌中，PcSEP1在质外体发挥作用，促进病原菌侵染和诱导宿主细胞死亡［67］。

3 辣椒疫病抗性机制

3.1 辣椒疫病抗性位点

辣椒对疫病的抗性主要包含由单一显性基因和数量性状位点(QTL)控制的遗传模型。研究表明，单一显性基因主要是对疫霉菌生理小种的特异性抗性［31，68-71］，然而辣椒对疫霉菌的抗性是一个由多基因控制的复杂性状，截至目前已鉴定大量的抗病相关的QTLs，遍布所有辣椒染色体，但绝大多数位点均集中在5号染色体(表2)。Lefebvre等［72］于1996年报道了首张基于DH群体的辣椒疫病抗性遗传图谱，鉴定了13个抗性QTLs，其中1个位于5号染色体(P5)的QTL对抗性有主要影响，解释了总方差的41%～55%。此后，大量研究通过利用不同的双亲和遗传群体、作图策略证实了位于5号染色体的这些QTLs［73-76］。在此基础上，Mallard等［71］开发标记对遗传图谱中5号染色体上的QTLs区间进行锚定，并结合Meta分析检测到3个连续的QTLs：Pc5.1(R2=10.50%～52.72%)、Pc5.2(R2=6.71%～12.96%)和Pc5.3 (R2=8.50%～27.67%)；其中，Pc5.1在来自4个抗性品系的6个子代中被检索到，且对不同地理来源的12个菌株具有广谱抗性。Liu等［77］通过BSA技术将单位置多态性(SPP)标记(Phyto5SAR)标记到位于辣椒P5的主效 QTL上，并在包含Phyto5SAR的scaffold194上鉴定到2个潜在的抗性基因NBS-LRR和SAR8.2A。随后，Wang等［78］将抗性基因定位到5号染色体上3.2cM的区间，结合基因注释信息和转录表达数据鉴定到Capana05g000764 和Capana05g000769 这2个候选基因。结合传统QTL作图与GWAS技术，Siddique等［79］在辣椒5号染色体上定位了3个不同来源菌株产生广谱抗性的3个主要效应位点(5.1、5.2和5.3)，并在QTL作图和GWAS共同区域预测了候选核苷酸结合位点基因簇：富亮氨酸重复序列(NBS-LRR)和类受体激酶(RLK)。利用先前报道的分子标记对5号染色体上的主要QTL区域 (6.2～139.2 Mbp)重新分析，Kim等［80］鉴定到候选抗性基因类似物，包括14个核苷酸结合位点的富亮氨酸重复序列、3个受体样激酶和1个受体样蛋白基因。Du等［81］将遗传标记固定在辣椒基因组序列上，构建了1个覆盖所有已报道的Pc5.1的扩展Pc5.1(Ext-Pc5.1)，结合转录数据发现区间内44个差异表达的基因均未见报道，其中抗菌肽-1基因 (SN1)可能是与抗病性有关的候选基因［82］。这些QTLs的鉴定为辣椒疫病抗性基因的克隆和抗性筛选标记的开发奠定了基础。

表2 已报道的辣椒疫病抗性QTLs

3.2 辣椒疫病抗性相关基因和基于组学的抗性遗传网络研究

目前，通过抗性QTLs发掘并鉴定的抗性基因还有限，但许多功能涉及辣椒对疫霉菌防御反应的基因已经被报道。几丁质酶蛋白基因CaChi和聚半乳糖酶抑制蛋白基因CaPGIP1可以直接抑制辣椒疫霉菌的生长［90-91］，并通过减少活性氧(ROS)的积累，触发超敏反应(HR)和防御相关基因的上调来增强对辣椒的抗性［91-92］。乙烯反应因子基因CaAP2/ERF064和CaPTI1负责触发细胞死亡，并参与茉莉酸/乙烯(JA/ET)信号通路，调节CaBPR1、CaBPR1、CaDEF1和CaSAR82的表达［93-94］。然而，SBP-box家族CaSBP08、CaSBP11和CaSBP12基因沉默植株表现出对疫霉菌的抵御能力增强，伴随着防御相关基因被强烈诱导，细胞损伤降低，表明这些基因对辣椒植株抵御疫霉菌侵染的防御反应具有负调控作用［95-97］。此外，CanPOD［98］、CaRGA2［99］、CaDIR7［100］和CaCIPK1［101］等基因也被报道可增强辣椒植株对疫病的抗性。虽然以往的研究有助于更好地了解辣椒对疫霉菌侵染的分子机制，但对参与防御的基因及其遗传网络的研究成果较少。

辣椒对疫霉菌的抗性是一个高度复杂的性状［12］。对于复杂的性状，关联信号往往分布在基因组的大部分区域，包括许多与抗病性没有明显联系的基因，但其在细胞中表达容易影响抗病相关核心基因的功能［102］。因此，开展辣椒疫病抗性遗传网络研究对系统揭示其抗性分子机制具有重要意义，但有关辣椒响应疫霉菌侵染机制和途径的研究有限。在最近的一项研究中，Li等［103］利用转录组技术分析了疫霉菌接种后抗性和易感辣椒根系在不同时间点的基因表达变化，发现在抗性材料中，苯丙烷类生物合成途径相关基因被显著诱导，表明苯丙类生物合成途径在辣椒根抗性中起着重要作用。另一项基于疫霉菌侵染的辣椒叶片的转录组研究揭示了与防御和信号响应相关的基因与分子功能、细胞成分和生物过程的共同协调参与辣椒对疫霉菌侵染的响应［104］。Rabuma等［105］研究了疫霉菌侵染过程中敏感和抗性辣椒基因型中的miRNA及其靶基因变化，其中30个靶基因与防御相关，进一步验证了8个靶基因和miRNA之间的关系，这为更好地理解辣椒疫病抗性的转录后调控机制提供了有价值的资源。

4 展望

疫霉菌侵染辣椒组织，同时辣椒对疫霉菌的入侵进行抵御，是一个相互作用的复杂过程。在此过程中，PAMP被细胞表面受体识别并触发PTI，启动应对病原菌入侵的第一道防线；此时疫霉菌分泌效应子以镇压或逃避PTI，宿主则通过对应的策略识别效应子并触发ETI，引起相关基因的表达、代谢物的积累及过敏反应等建立第二道防线。目前，大量的疫霉菌效应子及其靶向的宿主蛋白已经被鉴定，但辣椒中识别PAMP和效应子的受体还鲜有报道。自辣椒疫病发现以来，对其抗性机制的研究已取得了丰硕成果，大量的抗性位点被鉴定，然而这些位点大多以CM334、Perennial、PI201234等几个材料作为抗性亲本构建群体，此外还未鉴定出广谱的抗性位点，对已知位点内的基因挖掘和功能研究仍然有限。辣椒对疫病的抗性是高度复杂的性状，受多基因的共同作用，许多重要的基因座通常效应较小。因此，通过大规模资源抗性鉴定，利用全基因组关联分析(GWAS)来弥补传统QTL定位的不足，鉴定一些小效应的重要基因座。随着高通量组学技术的快速发展，综合利用多组学数据，从基因、RNA、蛋白、代谢，甚至表观遗传，如DNA修饰(甲基化)、RNA编辑、组蛋白修饰等多层面对辣椒—疫霉菌互作机制进行系统深入的研究，将有助于阐明辣椒疫病抗性的分子机制。